酸性代谢环境对心肌细胞分化影响的研究进展

基金项目：国家自然科学基金（82270255）

通信作者：穆军升，E-mail：wesleymu@hotmail.com

【摘要】以干细胞为基础的心肌再生是治疗心肌梗死的前沿课题，控制干细胞的代谢微环境能影响干细胞向心肌细胞的分化，在临床应用中有着广阔前景。pH值是心肌细胞发育过程中代谢环境的重要指标。乳酸作为主要的酸性代谢产物之一，是调节心肌细胞早期发育阶段酸性代谢环境的关键代谢产物。现就pH值在心肌细胞生存与分化过程中的影响及相关机制的研究进展做一综述。

【关键词】pH值；乳酸；干细胞；心脏分化；酸性代谢环境

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.06.013

Influence of Acidic Metabolic Environment on Differentiation of Cardiomyocytes

MAO Jiahao1，ZHOU Fan2，MU Junsheng1，3

（1.Department of Cardiac Surgery，Beijing Anzhen Hospital，Capital Medical University，Beijing Institute of Heart Lung and Blood Vessel Diseases，Beijing 100029，China；2.Department of Ultrasound，The Third Medical Center of

The General Hospital of The People’s Liberation Army，Beijing 100039，China；

3.Department of Cardiac Surgery，The Third Affilited Hospital of Xinxiang Medical University，Xinxiang 453000，Henan，China

）

【Abstract】Stem cell-based myocardial regeneration is a frontier topic in the treatment of myocardial infarction.Manipulating the metabolic microenvironment of stem cells can influence their differentiation into cardiomyocytes，which have promising clinical applications.pH is an important indicator of the metabolic environment during cardiomyocyte development.And lactate，as one of the main acidic metabolites，is a major regulator of the acidic metabolic environment during early cardiomyocyte development.Here，we summarize the progress of research into the influence of pH value and lactate on cardiomyocyte survival and differentiation，as well as related mechanisms.

【Keywords】pH value；Lactic acid；Stem cell；Cardiac differentiation；Acidic metabolic environment

心肌梗死是一种常见的致命性心脏疾病，近三四十年，心肌梗死的发病率在低、中等收入国家中逐渐上升［1］。由于心肌细胞的再生能力差，大量心肌细胞坏死会导致心脏纤维化和心力衰竭［2］。目前对于心力衰竭的治疗有药物治疗、心脏再同步化治疗、左心室辅助装置、心脏移植等。然而目前常用的药物治疗与辅助装置治疗并不能逆转心肌细胞的坏死。在过去的几十年里，心肌再生已成为治疗心肌梗死和心力衰竭的前沿课题，主要包括体外培养的心肌细胞移植，心脏组织工程，刺激内源性心肌细胞增殖和将非心肌细胞重编程为心肌细胞［2］。

心肌细胞的体外培养包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞在内的多能干细胞的培养，是用于治疗的心肌细胞的潜在来源［3］。心肌再生治疗中每个人所需的心肌细胞数大约为109个，因此以下的关键技术需重点考虑：扩大表观遗传学稳定的多能干细胞产量、有效且可重复的心肌细胞分化以及高度可靠的心肌细胞纯化与成熟［4］。心脏原位组织工程则是使用重组病毒，干扰RNA或调节细胞代谢环境等方法来刺激内源性心肌细胞的增殖［2，5］。事实上，哺乳动物的心脏仅在新生儿时期有短暂的自我修复能力［6-7］，成年哺乳动物的心肌细胞更新率极低且梗死后不足以再生［8-9］，新生成的心肌细胞很可能来自现有的心肌细胞［9］。在妊娠早期，哺乳动物胚胎在缺氧环境中发育，早期心肌细胞的发育高度依赖糖酵解，乳酸成为调节代谢微环境中pH值的基础。目前，有关心肌再生策略的一个新兴趋势是调节代谢微环境来诱导干细胞分化为心肌细胞，许多研究［10-11］证明代谢微环境对心肌细胞的分化过程有重要作用。现综述pH值与乳酸对心肌细胞生存以及分化的影响。

1" pH值与心肌细胞的生存

1.1" 心肌缺血损伤的发生机制及低pH值的保护作用

由于急性心肌梗死引起的炎症，梗死区局部的pH值往往低于心脏组织的生理pH值［12-13］。缺血导致的组织缺氧使细胞无氧糖酵解产生乳酸，而再灌注则使心肌梗死区复氧并恢复生理pH值［13］。虽然酸中毒常被认为不利于细胞生存，但近期研究［14-15］表明，酸中毒对心肌细胞、肝细胞等细胞缺血、缺氧的损伤有保护作用，然而，在较长的缺血过程之后的再灌注可能会引起细胞死亡，这种矛盾现象被称为pH悖论。

缺氧、缺血的组织经历再灌注后会发生氧化应激，并伴随氧自由基种类、细胞质Ca2+的增加和还原型谷胱甘肽的减少［16］。当细胞病理性地负载高水平Ca2+时，细胞内线粒体膜通透性会发生非特异性增加［16-17］，导致线粒体肿胀并解偶联，这一过程被称为线粒体通透性转变，从而形成线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）。具有MPTP的线粒体难以产生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）去修复缺血再灌注期间激活的钙离子依赖性蛋白酶、核酸酶和磷脂酶造成的损伤，肿胀的线粒体还能水解糖酵解产生的ATP以及剩余有功能的线粒体［17］。虽然细胞内的低pH值本身有害，但能保护细胞免受缺血再灌注过程中发生的不可逆细胞损伤［16］，这种保护作用是通过抑制MPTP的形成而产生的［12，16-17］。Cohen等［12］对局部缺血30 min的离体兔心脏进行分组实验，发现在离体心脏心肌梗死后直接再灌注恢复pH值的同时也促进了MPTP的产生；而相较于直接再灌注，再灌注前2 min使用酸性灌注液将显著减少心肌梗死面积。这提示了在对心肌梗死的再灌注治疗前维持短暂酸中毒对心肌细胞有一定的保护作用。

1.2" 酸中毒与心肌细胞移植

体外培养的心脏组织的开发与设计必须考虑心肌缺血的特定环境，否则体外培养的心肌细胞很可能在植入体内时坏死［5］。直接将干细胞注射到心肌梗死区会导致低细胞保留率，不利于长期移植［18-19］。Li等［20］开发设计了一种对pH值与温度均敏感的水凝胶作为心肌细胞的输送载体，能在梗死区pH值环境下凝固并保证细胞的保留率。总的来说，心肌梗死所致的低pH值对梗死区的心肌细胞有一定的保护作用，同时对体外培养心肌细胞的移植有指导意义。

2" pH值与心肌细胞的分化

2.1" 细胞内pH值与心肌细胞的分化

当心肌细胞内的pH值降低时，主要有两种离子转运蛋白被激活，分别是Na+-H+交换体（Na+-H+ exchanger，NHE）和Na+-HCO-3协同转运蛋白［21］。NHE是一种普遍存在的质膜糖蛋白，通过排出一个细胞内质子交换一个细胞外的Na+，达到调节细胞内pH值的目的［22］。NHE有9种亚型，NHE1是心脏组织中唯一的质膜亚型［23］。对每种转运蛋白清除细胞内酸负荷的贡献评估表明，NHE1是减少心肌细胞内酸负荷的主要转运蛋白［24］。此外，有研究［25］发现，Na+-HCO-3协同转运蛋白在pH值＞7时活性更强，当心肌细胞内pH值＜7时，NHE1蛋白对pH的调节更为关键，NHE1通过排出细胞内过量的酸来改善细胞内pH值。

研究［26］表明，在心脏发育过程中以及出生后的很短时间内，NHE1蛋白的表达水平升高。当出生后细胞分化减少时，NHE1的活性也随之下降［26-27］。Li等［22］首次研究了NHE1在胚胎干细胞分化中的影响，通过处理CGR8细胞（即小鼠胚胎干细胞）形成胚状体和心肌细胞，使用NHE1特异性抑制剂EMD887580处理的第8～12天，存在跳动的胚状体的百分比相较于对照组显著下降，α-肌球蛋白重链蛋白表达显著降低。更为重要的是，在使用NHE1特异性抑制剂处理的第12天，心肌分化的标志物转录因子NKX2.5和Tbx5显著下降［28］。此外，Li等［22］还使用含有NHE1的腺病毒感染CGR8细胞使其具有额外的NHE活性，含有NHE1的腺病毒感染增加了存在跳动的胚状体的百分比，提高了心肌细胞分化的几种标志物的水平。

值得注意的是，NHE1特异性抑制剂EMD887580在抑制NHE1活性与心肌分化过程之外并未影响NHE1的表达水平，这表明NHE1表达水平的变化可能独立于心肌分化过程，NHE1并不是心肌细胞分化的伴随产物［22］，然而NHE1活性影响心肌细胞分化的相关触发机制与信号通路有待进一步研究。

2.2" 细胞外pH值与心肌细胞的分化

在多能干细胞分化为心肌细胞的实际培养过程中，为了获得一定的细胞产量，细胞培养通常在较高的细胞密度下进行。然而高密度的细胞培养将不可避免地导致乳酸的积累。Liu等［29］的研究报道了人多能干细胞的高密度培养引起了培养基环境的低pH值，这样的低pH值环境抑制葡萄糖的消耗，且导致细胞周期的阻滞。而向培养基补充碳酸氢钠能抑制酸中毒并改善细胞存活，碳酸氢钠处理能显著提高心肌损伤标志物心肌肌钙蛋白（cardiac troponin，cTn）和NKX2.5的表达，促进多能干细胞向心肌细胞的分化。

3" 乳酸与心肌细胞的分化

3.1" 乳酸在心肌细胞早期发育过程中的作用

哺乳动物的心脏对能量的需求非常高，因其需要不断收缩以维持身体各个器官的氧气供应。它能利用所有类型的底物来产生能量，包括葡萄糖、乳酸、酮体以及氨基酸［30］。在妊娠早期的缺氧环境中，胎盘产生大量的乳酸［31-33］，成为人类胚胎早期发育的重要底物［33-34］。

胎儿出生后，大量氧气进入心脏，使得心肌细胞的代谢环境发生改变，细胞糖酵解与乳酸水平下降，心肌细胞的线粒体氧化能力增强，脂肪酸β氧化成为心脏的主要能量来源［35］，心肌细胞伴随着糖酵解到氧化磷酸化这一代谢转变进入终末阶段的分化［36］。

3.2" 乳酸对心肌细胞分化的影响

Ordoo等［5］分别研究了乳酸对于小鼠新生心肌细胞以及人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的影响，通过评估表达增殖的标志物Ki67以及表达细胞分裂的关键调节因子极光激酶B，发现乳酸能显著增加Ki67+cTnT+和AurB+cTnT+的心肌细胞，提示乳酸的存在能增加心肌细胞周期活性，刺激心肌细胞的增殖活动。此外，乳酸对成纤维细胞的数量无影响，提示乳酸刺激细胞增殖的效应是心肌细胞特有的；RNA测序与基因表达分析的结果表明，使用乳酸盐培养的心肌细胞表现出BMP10、LIN28和TCIM的表达上调与GRIK1或DGKK等的表达下调。BMP10是一种分泌蛋白，能诱导心肌细胞增殖并阻止心脏细胞成熟［37-38］，LIN28与干细胞的代谢以及多能性有关［10］，并调节早期心肌细胞的激活［39］，而TCIM与细胞的低分化状态有关［40］。GRIK1被认为能抑制细胞增殖［41］，而DGKK则与心肌细胞的肥大有关［42］。这些结果在基因表达的层面同样提示了乳酸刺激心肌细胞增殖的作用。研究团队［43］为了阐明乳酸对心肌细胞的调控机制，使用人类基因数据库GeneCards来与人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞培养中发生上调或下调的基因进行比对，发现与这些基因相关的转录因子结合位点大多与缺氧信号通路有关，其中SP1、MEF2A、CREM已被证实参与低氧条件下的心脏保护或心肌细胞的增殖，这些结果提示乳酸可能与心肌细胞缺氧信号通路的激活有关，乳酸通过对心肌细胞在基因层面的调控，使得心肌细胞处于低分化阶段以促进其增殖活动。

Du等［43］报道了一种由五种小分子组成的化学混合物，能有效地使心肌细胞重新进入细胞周期和细胞分裂阶段，并且诱导心肌细胞在进入增殖之前去分化。值得注意的是，在这种化学混合物处理的新生大鼠心室肌细胞中，细胞内乳酸浓度提升到两倍，并且直接提高了培养基的乳酸水平。通过对代谢基因变化的分析，心肌细胞的糖酵解水平上升，氧化磷酸化水平下降。Du等［43］的研究表明，乳酸能通过LacRS2介导丙酮酸脱氢酶α1（pyruvate dehydrogenase alpha 1，PDHA1）重组蛋白和肉碱棕榈酰基转移酶2（carnitine palmitoyltransferase 2，CPT2）重组蛋白这两种线粒体蛋白的乳酸化从而产生抑制作用，这两种关键酶分别催化丙酮酸生成乙酰辅酶A和长链脂肪酸的氧化，而上面所叙述的化学混合物恰好能增加PDHA1和CPT2的乳酸化。敲低LacRS2 siRNA或者β-丙氨酸抑制LacRS2，都能降低乳酸化的PDHA1水平和进入细胞周期的心肌细胞的数量。以上结果表明，对于能促进心肌细胞去分化和增殖的化学混合物，乳酸-LacRS2很有可能是其下游信号通路，诱导心肌细胞增殖，并使得细胞代谢由氧化磷酸化向糖酵解转变。

Tohyama等［44］使用含丰富乳酸的无葡萄糖培养基培养多能干细胞的衍生物，发现只有心肌细胞存活，并获得了纯度为99%的心肌细胞，同时，经过乳酸纯化的心肌细胞显示出增殖能力的增强。基因表达分析提示心肌细胞相关基因的mRNA MYH6表达升高，非心脏基因（NANOG、MYOD、AFP和MAP2）的mRNA被完全消除，其他心肌细胞相关基因（ACTC1和NKX2.5）的mRNA显著富集。

3.3" 乳酸与pH值的非一致性关系

值得注意的是，Tohyama等［44］经过乳酸浓度的优化后选择了4 mmol/L作为最佳乳酸浓度，因为在该乳酸浓度下多能干细胞在分化的第20～30天产生了最高的心肌细胞纯度和产量，并且在细胞培养过程中产生了最低的细胞死亡数量。此外，外源性的乳酸补充可能导致培养基中细胞内外环境的酸化。Tohyama等［44］研究了4 mmol/L的乳酸是否影响细胞内外pH值，实验证实，在5%CO2细胞培养箱中孵育1 h后，细胞外pH值稳定在7.5，并且心肌细胞内的pH值不受影响。这些结果表明，乳酸对多能干细胞衍生的心肌细胞的影响并不依赖pH值，而更有可能是乳酸本身产生的影响。

4" 问题与展望

心肌细胞内pH值主要由NHE1调节，NHE1的活性增强对于促进心肌细胞分化的分子机制尚未阐明。对于心肌细胞的体外培养，抑制高密度培养引起的酸中毒能促进心肌细胞的分化，但相关机制仍有待探索。以胎儿心脏为例，心肌细胞早期发育的代谢环境富含乳酸，能促进心肌细胞的去分化并增强其增殖能力；就体外培养而言，乳酸能有效增加干细胞向心肌细胞分化的比例以及心肌细胞的产量，通过乳酸调控细胞代谢环境在实际临床应用中有着广阔的治疗前景。

5" 总结

针对心肌梗死的干细胞治疗被认为是有着广阔前景的前沿课题。心肌梗死时的缺血区通常有着较低的pH值，缺血再灌注治疗前维持短暂酸中毒通过抑制MPTP对心肌细胞产生一定的保护作用。同时，哺乳动物心肌细胞的早期发育环境是缺氧且富含乳酸的，酸性代谢环境对干细胞向心肌细胞分化的影响有着显著的研究意义。

无论是NHE1的活化降低心肌细胞内酸负荷，还是在多能干细胞衍生的心肌细胞体外培养环境中补充碳酸氢钠抑制酸中毒，均促进了心肌细胞的分化。这些结果表明，降低细胞内酸负荷与抑制细胞外酸中毒均能改善心肌细胞的分化。乳酸作为心脏早期发育的主要能量底物，通过基因层面的调控使得心肌细胞去分化并增强其增殖能力，在心脏原位组织工程中有广阔的治疗前景，即通过乳酸刺激内源性心肌细胞的增殖；在心肌细胞的体外培养中，乳酸能有效提高干细胞分化成为心肌细胞的比例及产量，在心肌细胞培养的实际应用中有至关重要的意义。

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收稿日期：2023-10-29