多拷贝pucBA基因在沼泽红假单胞菌光合生长中的作用

摘要： 选择沼泽红假单胞菌CGA009菌株，采用基因敲除方法，依次对菌株中的5对pucBA基因进行敲除，以探求不同pucBA基因对菌株光合生长、光谱表型和光合色素质量浓度的影响。结果表明：不同pucBA基因的表达量与菌株光合生长速率和光合色素合成量呈正相关关系；高光下pucBAb和pucBAa基因对菌株生长发挥主要作用，低光下pucBAb，pucBAd和pucBAa基因对菌株生长起主要作用；敲除pucBAd基因可导致pucBAb基因高效表达，敲除pucBAc基因可导致LH1-RC合成量提高，表明某个pucBA基因的敲除对其他光合基因表达具有补偿作用。

关键词： 紫细菌； 沼泽红假单胞菌； 外周捕光复合体（LH2）； 基因敲除

中图分类号： Q 78文献标志码： A"" 文章编号： 1000-5013（2024）05-0610-08

Role of Multiple Copy pucBA Genes in Phototrophic Growth of Rhodopseudomonas palustris

Abstract： Selecting Rhodopseudomonas palustris CGA009 strain， gene knockout method was used to sequentially knock out five pairs of pucBA genes in the strain in order to explore the effects of different pucBA genes on photosynthetic growth， spectral phenotype and photosynthetic pigment mass concentration of the strain. The results showed that the expression levels of different pucBA genes were positively correlated with the photosynthetic growth rate and photosynthetic pigment synthesis of the strain. The pucBAb and pucBAa genes played a major role in strain growth under high light conditions， while the pucBAb， pucBAd and pucBAa genes played a major role in strain growth under low light conditions. Knocking out the pucBAd gene could lead to efficient expression of pucBAb gene， while knocking out the pucBAc gene could increase LH1-RC synthesis， indicating that the knockout of a certain pucBA gene had a compensatory effect on the expression of other photosynthetic genes.

Keywords：

purple bacteria； Rhodopseudononas palustris； peripheral light-harvesting complex （LH2）； gene knockout

不产氧光合细菌（APB）因其光合单元简单，常作为光合作用机制研究的模型生物［1-2］。由于自然光的不连续性，APB形成了2种机制应对光环境的变化。一种是调控光合单元中外周捕光复合体（LH2）和核心捕光复合体-反应中心复合物（LH1-RC）的数量以适应光变化，通常LH1与RC形成1∶1的复合体［3-4］，随着光照强度升高，LH2/LH1-RC的比例降低［5-6］。另一种是随着光照强度变化，LH2光谱类型也随之变化［5-6］，高光时菌株形成典型光谱LH2（T-LH2），又称B800-850 LH2，低光时形成异常光谱LH2（U-LH2），主要包括LH3（B800-820 LH2），LH4（B800-only或B800-low-850 LH2）和LH2′（B800-840 LH2）等［7-9］。目前，研究已阐明了不同光谱类型LH2的形成机制及随光变化机制，其原因是菌株拥有多拷贝编码LH2 αβ肽的pucBA基因，在不同光环境中多拷贝pucBA的表达量不同，由于不同pucBA基因编码的αβ肽氨基酸残基的差异，导致不同αβ肽与细菌叶绿素（BChl） a结合位点和配位方式不同，从而形成不同的特征光谱LH2［9-11］。基因组和系统发育分析显示，多拷贝pucBA基因在隶属于APB的紫细菌中广泛存在，尤其在红假单胞菌属菌株中的拷贝数可高达5～7对［5，9］。由于多拷贝pucBA基因同时表达，导致菌株中不同的LH2难以彼此分离，即使是高度纯化的LH2，也是不同LH2的混合物［10-13］。针对该问题，Southall等［2］和Qian等［1］分别以沼泽红假单胞菌（Rhodopseudononas palustris，Rps. palustris） CGA009和2.1.6为研究对象，采用基因敲除的方法得到仅剩1对pucBA基因的菌株，纯化得到单一基因型的LH2，不仅证明LH4均为B800-noly LH2［1-2］，而且高分辨地解析了4种LH2的晶体结构［1］，但并没有报道这4种单一基因型LH2的光能传递活性［1］。

LH2功能活性评价通常采用Cogdell建立的检测光能传递效率的方法，目前研究仅在固氮红细菌（Rhodobacter azotoformans） 134K20、嗜温紫色硫光养细菌（Allochromatium vinosum）和Rps. palustris CGA009等极少数菌株中比较了高、低光下纯化LH2的光能传递效率［5，14］，但该法依赖于LH2的分离纯化，而LH2彼此间难以纯化，所提供的数据往往是菌株同时表达不同LH2的综合结果［5］。归根结底，LH2的作用主要是推动菌株进行光合作用、促进生长，但目前还没有足够的数据来评估LH2在菌株光合作用代谢过程中的功能活性。Zhao等［5］采用Cogdell法比较研究了Rps. palustris CGA009菌株在高、低光下U-LH2（LH4）和T-LH2的能量传递活性，进一步敲除菌株中的pucBAd基因（编码LH4的αβ肽），探求LH4在菌株光合生长中的作用。基于此，本文采用遗传解剖的策略，在前期敲除pucBAd基因基础上，依次敲除菌株的pucBAa，pucBAb，pucBAe和pucBAc基因，分别在高、低光下，考察基因缺失对菌株光合生长、光谱表型和光合色素质量浓度的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

Rps. palustris CGA009（野生株WT），购自美国ATCC公司。Rps. palustris CGA009 pucBAd基因敲除株简称Δd，克隆菌株大肠杆菌（E. coli） JM109，由实验室保存。二氨基庚二酸（DAP）营养缺陷型E. coli WM3064，由中国科学院水生生物研究所邱东茹研究员馈赠。质粒pJQ200SK（携带硫酸庆大霉素抗性基因Gm和蔗糖筛选标记基因sacB），购自武汉淼灵生物公司。

1.2 主要试剂

基因组DNA提取试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司。质粒提取试剂盒和通用型DNA纯化回收试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司。PrimerSTAR○R HS DNA Polymerase、限制性内切酶（Pst Ⅰ，Xba Ⅰ和Xho Ⅰ）和T4 DNA 连接酶等，均购自日本Takara公司。甲醇、丙酮、异丙醇等为色谱纯试剂，其余试剂为分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 培养基和培养条件

采用改良Ormerod液体培养基和18#固体培养基［5］。改良Ormerod液体培养基培养容器为螺口蓝盖瓶，接种后用培养基充满140 mL蓝盖瓶，在30 ℃，白炽灯光源2 000 lx（高光）和200 lx（低光）条件下，厌氧培养Rps. palustris CGA009菌株的基因缺失菌株。E. coli采用LB培养基，37 ℃培养，根据需要添加DAP，Gm和蔗糖。

1.4 基因敲除和验证

在巢式聚合酶链式反应（PCR）验证pucBAd敲除株（Δd）基因缺失正确的基础上，以Δd菌株作为出发株，依次敲除菌株中的pucBAa，pucBAb，pucBAe和pucBAc基因，得到pucBAda，pucBAdab，pucBAdabe和pucBAdabec基因缺失突变株，分别简称为Δda，Δdab，Δdabe和Δdabec菌株。pucBAd，pucBAa，pucBAb，pucBAe和pucBAc基因敲除片段的长度分别为381，408，412，584和404 bp。

采用环状质粒介导的双交换同源重组法进行基因敲除［5］。以CGA009基因组DNA为模板，采用PCR法分别扩增敲除目的基因上游（U）和下游（D）DNA片段，采用PCR法拼接上、下游DNA片段，构建重组质粒pJQ200SK-UD，转化E. coli DH5α，涂布LB抗性（Gm）平板，筛选重组子，并进行PCR验证。提取重组质粒pJQ200SK-UD，转化E. coli WM3064，经Gm抗性筛选和PCR验证，得到重组菌株E. coli WM3064（pJQ200SK-UD）。采用双亲交配的方法［5］，通过E. coli WM3064将质粒pJQ200SK-UD接合转移至受体菌，将接合转移的菌悬液涂布在18#固体培养基（100 μg·mL-1的Gm，不含DAP）上，培养5～7 d，挑选菌落，在含体积分数为10%蔗糖的18#固体培养基平板上划线，挑选菌落，分别用不同引物，通过巢式PCR筛选和验证目的基因缺失突变株。

使用的引物序列、酶切位点和扩增产物，如表1所示。表1中：F，R分别为pucBA基因的正向、反向引物；UF，UR分别为pucBA基因上游片段的正向、反向引物；DF，DR分别为pucBA基因下游片段的正向、反向引物；下标a，b，c，e分别为pucBA基因编号；CTGCAG为Pst Ⅰ酶切位点，CTCGAG为Xho Ⅰ酶切位点，TCTAGA为Xba Ⅰ酶切位点；双下划线序列为PCR拼接互补序列。

1.5 光合生长、吸收光谱和光合色素质量浓度的测定

离心收集低光培养3 d的pucBA基因缺失株菌体，调整菌悬液吸光度D（660）为1.50，按体积分数为3%的接种量接种至改良Ormerod液体培养基中。分别设置光照强度为2 000 lx和200 lx，以WT为对照，进行3组重复实验。培养过程中取样测定菌体生物量和吸收光谱。生物量以D（660）表示，绘制生长曲线。通过分析活细胞吸收光谱的特征峰的波长和吸光度的变化，表征pucAB基因敲除对菌株LH2合成能力的影响。使用基准线法计算特征光谱的吸光度值（D），其计算公式为

D=DT-DRL。

上式中：DT与DRL分别为特征光谱的总吸光值和参考线（RL）的吸光值。

用DWT表示野生型菌株的吸光度值，通过公式R=D/DWT×100%计算敲除菌株和野生型菌株间的相对生长速率。用ΔR表示相对变化量，即pucAB基因敲除后与敲除前相对生长速率的差值。

采用超声法提取菌体光合色素。按质量体积比（g∶mL）为1∶12向菌体中加入色素提取液（丙酮-甲醇按照体积比7∶2配制而成）提取光合色素，将3次提取液合并定容至10 mL，取样测定其吸收光谱。BChl a和Car的最大吸收波长分别为770，476 nm，BChl a和Car的质量浓度（ρ）计算公式为

ρ=DVf/（aL）。

上式中：a为摩尔消光系数，Car和BChl a摩尔消光系数分别为160，76 L·mol-1·cm-1［14-15］；L为光程；D，V和f分别表示样品的吸光度、体积和稀释因子。

2 实验结果与分析

2.1 基因敲除和突变株验证

以UF/DR为引物，基因敲除前、后菌株PCR扩增的目标条带大小，如图1（a）所示。由图1（a）可知：扩增条带与预期大小吻合；与基因敲除前菌株相比，pucBA基因缺失株未检测到相应大小的DNA条带，检测到相对分子质量较小的DNA条带，与缺失基因片段基本吻合，表明基因敲除菌株靶基因片段缺失。以F/R为引物，基因敲除前、后菌株PCR扩增目标条带的大小，如图1（b）所示。由图1（b）可知：扩增条带与预期片段大小相吻合，与敲除前相比，基因敲除后的菌株未检测到相应大小的DNA条带，表明基因敲除菌株靶基因被敲除。由此表明，WT（CGA009）敲除pucBAd基因菌株（Δd）的基因缺失正确，以Δd菌株作为出发株，依次敲除菌株中的pucBAa，pucBAb，pucBAe和pucBAc基因，相继获得了Δda，Δdab，Δdabe和Δdabec菌株。

2.2 基因缺失对菌株吸收光谱的影响

由于LH2具有特征近红外（NIR）吸收光谱，常常用活细胞NIR光谱反映LH2特征和表达量的变化。pucBA基因敲除株在高光和低光下的NIR特征光谱，如图2所示。图2中：λ为波长。低光下pucBA基因敲除对菌株NIR特征光谱的影响，如表2所示。表2中：λP1，λP2分别为特征峰P1，P2对应的波长；Dmax为吸光度峰值。

由图2（b），表2可知：低光时，WT菌株呈现P1（805 nm）和P2（864 nm）2个NIR特征峰，且特征峰P1吸光度（DP1）gt;特征峰P2吸光度（DP2）；随着5对pucBA基因的依次敲除，缺失株的P1最大波长（λmax）在803～805 nm范围内变化，Dmax呈逐渐降低（Δd，Δda，Δdab和Δdabe）、再升高（Δdabec）现象；P2峰的最大波长明显红移，从864～865 nm（Δd，Δda和Δdab）红移至881～883 nm（Δdabe，Δdabec），Dmax呈现先升高（Δd）、后逐渐降低（Δda，Δdab和Δdabe）、再升高（Δdabec）的现象。但不同敲除株的P1和P2特征峰吸光度峰值（Dmax）的降低或升高的幅度（ΔR）不同。

由于T-LH2，U-LH2（LH4）和LH1-RC分别呈现B800-850，B800-only和B800-875特征峰，它们的光谱发生相互叠加，从而形成菌体的P1和P2特征峰，pucBA基因敲除前后特征峰变化可反映pucBA基因的表达情况。由表2可知：与相应基因缺失前的菌株相比，Δd，Δda，Δdab，Δdabe和Δdabec缺失株P1峰吸光度的相对变化（ΔR）分别为-35.0%，-9.3%，-33.7%，-4.2%和14.6%，P2峰吸光度的ΔR分别为35.9%，-13.2%，-48.0%，-9.8%和27.6%。

由此可知以下3点结论：1） 在低光环境中，pucBAd，pucBAb和pucBAa是主要表达合成LH2的基因，表达量高低顺序为pucBAbgt;pucBAdgt;pucBAa，pucBAe和pucBAc表达量则更低；2） 由于Δda敲除株的P2峰吸光度高于WT菌株，表明敲除pucBAd有利于pucBAb基因的高效表达，由于pucBAb表达b-LH2合成量升高，导致P1特征峰将升高，从而低估了Δd菌株P1特征峰降低的程度；3） 与Δdabe菌株相比，由于Δdabec菌株的D（805）和D（881）升高，由此说明尽管已有研究表明pucBAc是伪基因，不能合成LH2［9］，但敲除该基因有利于菌株中LH1-RC合成量升高，表明pucBAc对LH1-RC基因的表达具有抑制作用。

由图2（a）和表3可知：高光时pucBAd基因表达d-LH2合成量很低［5，9］，WT菌株呈现805 nm（P1）和866 nm（P2）特征峰，且DP2高于DP1，与文献结果一致［5］；随着pucBA基因的依次敲除，P1峰位变化范围在804～805 nm，P2峰则从866～867 nm（Δd和Δda）红移至876～878 nm（Δdab，Δdabe和Δdabc），其中，Δdab红移幅度最大，从867 nm红移至876 nm；与相应的未敲除株相比，Δd和Δdabec敲除株的DP1，DP2，D（866）升高，而Δda，Δdab和Δdabe敲除株降低，降低幅度（ΔR）为Δdabgt;Δdagt;Δdabe。由此表明：在高光条件下，菌株主要表达的基因是pucBAa和pucBAb，且pucBAb表达量高，次要表达基因是pucBAe，未检测到pucBAd和pucBAc基因的表达。虽然pucBAd基因表达量很低，但敲除该基因促进了菌体中其他pucBA的LH2合成。敲除pucBAc则有利于LH1-RC表达。

2.3 基因缺失对菌株光合生长的影响

pucBA敲除株在高光和低光下的生长曲线，如图3所示。由图3可知：高光条件下，随培养时间的延长，各敲除株光合生长速率有所不同，但稳定期的生物量差异较小；与高光条件相比，低光下各敲除株的光合生长速率和最大生物量都有所不同。

pucBA敲除株在高光和低光下的相对生长速率（R），如图4所示。图4中：字母α， β， γ， δ ，ε表示显著性差异分析，不同字母间的差异具有统计学意义（Plt;0.05）；“-”表示与未敲除株相比，敲除株生长速率升高。由图4可知：高光和低光条件下，Δdabec菌株的相对生长速率（R）分别为29.4%和41.0%，即5对pucBA完全敲除使生长速率降低了70.6%和59.0%，表明pucBA基因在菌株光合生长过程中发挥重要的作用；随着5对pucBA依次敲除，在高光条件下，与相应的未敲除株相比，Δd，Δda，Δdab，Δdabe和Δdabec缺失株相对生长速率分别降低了2.1%（Δd），22.9%（Δda），43.1%（Δdab），-3.3%（Δdabe），5.8%（Δdabec），在低光条件下，分别降低了20.1%，11.3%，24.1%，-4.0%和7.5%。由此可见，高光时pucBAa和pucBAb对菌株的光合生长发挥主要作用，且pucBAbgt;pucBAa，而pucBAd，pucBAe和pucBAc的作用较小；低光时pucBAd，pucBAa和pucBAb对菌株生长发挥主要作用，且pucBAbgt;pucBAdgt;pucBAa，pucBAe和pucBAc的作用较小。Δdabe菌株在高光和低光下生长速率反而有所升高，但差异无统计学意义（Pgt;0.05）；pucBAc是伪基因［9］，但敲除该基因对生长有明显抑制作用。由此表明，敲除pucBAe和pucBAc仍影响菌株的生长和代谢，但总体上对生长影响较小。与菌株特征光谱结果相比可知，敲除pucBA基因对菌株生长的抑制作用与特征光谱吸光度降低的程度呈正相关关系，即敲除表达量高的pucBA基因对生长的抑制作用大，反之则小；光谱分析表明，敲除pucBAd，Δd菌株LH2表达量升高，但高光时菌株的生长速率并没有升高，反而有降低的趋势，其原因可能是高光时高表达量的LH2对菌株光损伤作用较大。

2.4 基因缺失对菌株光合色素的影响

敲除pucBA基因对菌体BChl a和Car质量浓度（ρ）的影响，如图5所示。由图5可知：与基因敲除前菌株相比，高光下，Δda，Δdab，Δdabe菌株的BChl a和Car的质量浓度均显著降低（Plt;0.05），降低幅度为Δdabgt;Δdagt;Δdabe，Δd和Δdabec菌株BChl a和Car的质量浓度虽然升高，但差异无统计学意义；低光下，Δd，Δda，Δdab菌株的BChl a和Car的质量浓度均显著降低（Plt;0.05），降低幅度为Δdabgt;Δdgt;Δa，Δdabe菌株的BChl a和Car质量浓度未显著降低，Δdabec菌株BChl a的质量浓度有所升高，但差异无统计学意义，而Car质量浓度显著升高。由此可见，敲除表达量高的pucBA基因，菌株光合色素的质量浓度降低幅度大。这与敲除株光合生长和NIR光谱测定的LH2表达量的结果基本吻合，也与光合色素主要定位在LH2和LH1-RC上的报道结果相吻合［16］。但敲除pucBAd和pucBAc基因，菌体积累的光合色素质量浓度升高，这与基因敲除导致菌株中其他pucBA或LH1-RC表达量升高的结果相吻合。

3 结论

目前研究主要从转录水平上揭示高低光与菌株多拷贝pucBA基因表达的关系［9］，尚缺乏转录表达产物（LH2）合成和功能活性的证据。采用遗传解剖策略，依次敲除多拷贝pucBA基因，通过光合生长、LH2特征光谱和光合色素合成量等指标综合评价，分析多拷贝pucBA基因对菌株生存的贡献。

研究结果显示：敲除不同的pucBA基因对菌株生长的影响程度不同，基因的表达量与菌株光合生长和光合色素合成量呈正相关关系，即主要功能基因被敲除，严重制约菌株的生长、LH2合成和光合色素积累，敲除次要功能基因则影响较小。高光时，pucBAa和pucBAb基因是主要功能基因，对生长的贡献率大小为pucBAbgt;pucBAa；低光时，pucBAd，pucBAa和pucBAb是主要功能基因，贡献率大小为pucBAbgt;pucBAdgt;pucBAa；无论高光还是低光，pucBAb对菌株光合生长的贡献最大，文中结果与转录组文献报道的结果相矛盾［9］。特征光谱显示，敲除pucBAd基因，LH2相对含量不但不降低，反而升高，光合色素的质量浓度同样有升高趋势，由此表明，敲除该基因有利于菌株中其他pucBA的高效表达，对LH2合成具有补偿作用，这与本课题组前期研究结果一致［5］。但研究结果进一步显示，在低光条件下，敲除pucBAd基因有利于pucBAb基因高效表达。转录组文献结果显示，CGA009菌株在高光和低光条件下pucBAb基因为次要表达的功能基因［9］，而文中结果显示，pucBAb基因对菌体光合生长贡献最大，由此明确，无论高光和低光，敲除pucBAd基因都能诱导pucBAb基因高效表达，这也是文中结果与转录组研究结果相矛盾的原因。另外，高光条件下pucBAd基因转录表达量极低［9］，但敲除pucBAd基因，LH2合成量升高，菌株生长速率没有升高，反而有所降低的原因可能是高光下，LH2表达量高，光能吸收和传递活性高，对菌株的光损伤也增大，从而导致菌株生长速率没有升高。敲除pucBAc基因促进LH1-RC合成量升高，表明pucBAc基因对LH1-RC合成具有抑制，其抑制机制有待深入研究。由此可见，多拷贝pucBA有利于菌株适应不同的光环境，不同光环境中不同的pucBA表达，其表达产物的功能势必与其环境相适应，因此，多拷贝pucBA表达调控的机制还有待深入研究。

通过遗传解剖策略，依次敲除CGA009菌株中的5对拷贝pucAB基因，阐明了多拷贝pucBA基因的缺失与菌株光合生长、光谱表型和光合色素合成的关系和规律，评价了5对pucBA在CGA009菌株中的功能和作用，即pucBAa，pucBAb和pucBAd对该菌株的光合生长发挥主要作用，其中，pucBAd主要在低光时发挥作用。研究发现，敲除pucBAd诱导pucBAb的高效表达，敲除pucBAc诱导LH1-RC合成量升高。研究为多拷贝pucBA功能和活性评价提供一种思路和方法。

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