叶面喷施乙烯利对银杏叶生物量、生理及品质的影响

摘 要：【目的】探讨不同外源乙烯利浓度对银杏叶生物量、生理及品质的影响，为提高银杏叶片药用有效成分提供理论指导。【方法】以3年生银杏实生苗为材料，喷施4种浓度的乙烯利（200、400、600、800 mg·L-1），30 d后采样。测定叶生物量、可溶性糖、可溶性蛋白、内源激素及萜内酯类化合物含量等，并进行相关性分析，筛选有利于银杏叶生物量积累、生理代谢和品质提高的外源乙烯利浓度。【结果】除800 mg·L-1的处理组外，其余处理组叶生物量均高于对照但未达到显著差异水平。外源乙烯利浓度不同程度地提高了银杏叶总叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白的含量。800 mg·L-1的乙烯利处理显著提高了银杏叶片中萜内酯类化合物的含量，与对照组相比提高了13.41%。此浓度下，赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）含量显著增加。高浓度乙烯利（>500 mg·L-1）处理组银杏内酯A（GA）含量显著高于对照，除600 mg·L-1的处理组外，其他浓度处理组的银杏内酯B（GB）含量均显著高于对照组，不同浓度乙烯利处理均显著降低了白果内酯（BB）含量，而对银杏内酯C（GC）含量无显著影响。相关性分析表明，GA含量与叶绿素a、总叶绿素呈显著负相关，与类胡萝卜素呈极显著负相关。GB含量与ABA呈显著正相关，与生长素（IAA）、GA3、玉米素（ZR）呈显著正相关。GC、BB含量与ZR呈显著正相关。基于主成分分析得出各乙烯利喷施浓度的综合得分由高到低依次为800、600、400、200、0 mg·L-1。【结论】喷施适宜浓度的乙烯利能有效促进银杏叶生物量的积累，增强初生代谢，提高银杏叶中萜内酯化合物的含量，适宜的乙烯利喷施浓度为800 mg·L-1。

关键词：乙烯利；叶生物量；生理；品质

中图分类号：S792.95 文献标志码：A 文章编号：1673-923X（2024）06-0112-08

基金项目：国家自然科学基金项目（31971689）。

Effects of ethephon application on biomass， physiology and quality of Ginkgo biloba leaves

HOU Huifenga，b， ZHANG Jingjinga，b， LUO Yixuana，b， WANG Guibina，b

（a. Southern Modern Forestry Collaborative Innovation Center； b. College of Forestry and Grass， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， Jiangsu， China）

Abstract：【Objective】To investigate the effects of different concentrations of exogenous ethephon on the biomass， physiology and quality of Ginkgo biloba leaves， and to provide theoretical guidance for improving the medicinal active components of G. biloba leaves.【Method】The three-year-old G. biloba seedlings were sprayed with 4 concentrations of ethephon （200， 400， 600， 800 mg·L-1） and sampled 30 days later. Leaf biomass， soluble sugars， soluble proteins， endogenous hormones and terpene lactones were measured， and the correlation analysis was carried out.【Result】Except for the 800 mg·L-1 treatment group， the leaf biomass of the other treatment groups was higher than that of the control group but did not reach a significant difference level. The contents of total chlorophyll， soluble sugar and soluble protein in G. biloba leaves were increased by exogenous ethephon concentration. The contents of terpene lactones in ginkgo leaves were significantly increased by 800 mg·L-1 ethephon treatment， which was 13.41% higher than that in control group. At this concentration， the contents of gibberellin （GA3） and abscisic acid （ABA） increased significantly. Ginkgolide A （GA） in high concentration ethephon （>500 mg·L-1） treatment group was significantly higher than that in control group， except for 600 mg·L-1 treatment group， the content of ginkgolide B （GB） in other concentration treatment groups was significantly higher than that in control group， and the content of ginkgolide （BB） was significantly reduced under different concentrations. The content of ginkgolide C （GC） was not significantly affected. Correlation analysis showed that GA content was negatively correlated with chlorophyll a and total chlorophyll， and was negatively correlated with carotenoids. The content of GB was positively correlated with ABA， auxin （IAA）， GA3 and zeatin （ZR）. The contents of GC and BB were positively correlated with ZR. Based on principal component analysis， the comprehensive scores of ethephon spray concentration were 800， 600， 400， 200， 0 mg·L-1 from high to low.【Conclusion】Application of appropriate concentration of ethephon can effectively promote the accumulation of biomass in G. biloba leaves， enhance primary metabolism， and increase the content of terpene lactone compounds in G. biloba leaves. The appropriate concentration of ethephon is 800 mg·L-1.

Keywords： ethephon； leaf biomass； physiology； quality

银杏Ginkgo biloba属裸子植物门Gymnospermae银杏科Ginkgoaceae银杏属Ginkgo，是原产中国的重要经济树种[1]。银杏叶中含有多种重要次生代谢产物，如类黄酮、萜内酯类化合物、聚戊烯醇、有机酸、多糖等，均具有一定的药用价值[2]。银杏萜内酯为银杏独有的活性成分，是评价银杏叶品质的重要指标。银杏萜内酯分为二萜内酯和倍半萜内酯，二萜内酯有银杏内酯A、B、C、J、K、L、M、N、P、Q等10种；倍半萜内酯仅有白果内酯（Bilobalide，BB）一种[3]。银杏萜内酯具有抗炎、抗氧化、保护神经及心脑血管等广泛的药理作用，还对包括膀胱癌、结肠癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤的治疗有积极作用[4-5]。随着银杏叶片提取物（GBE）的药用价值被不断认识和开发，市场需求也在不断地扩大[6]。萜内酯作为GBE的重要组分，人工合成仍无法满足商业化规模生产的需要，从叶中提取、分离仍是最直接有效的方式[7]。据统计，全世界平均每天消耗600万种银杏叶提取物产品，而药用银杏叶提取物的消耗高达15万 kg。我国每年干银杏叶需求量约3万t，而市场只能供给约1万 t[8]。中国作为土地资源珍贵的农业大国，银杏叶用林栽培面积有限，如何在已有种植规模下，提高单位面积的银杏叶产量和有效成分含量是当前亟待解决的问题。

目前，已经证明矮壮素[9]、水杨酸[10]、茉莉酸甲酯[11]等多种激素施用对提高银杏中萜内酯类化合物含量有重要作用。2-氯乙基磷酸又名乙烯利（Ethephon， ETH），是乙烯的缓释剂。在多种植物的植株、细胞培养体系和毛状根培养体系中，都已证明乙烯对于促进次生代谢物合成具有重要作用。乙烯对次生代谢的促进作用主要受AP2/ ERF家族转录因子的调控，该家族转录因子通过结合下游启动子区域含GCC-box的基因来编码乙烯信号途径末端效应蛋白，最终作用于次生代谢物的合成[12]。相关研究也表明，乙烯可以诱导GbHMGR2和GbHMGR3等甲羟戊酸代谢途径中关键基因的表达，直接参与萜内酯的生物合成[13]。

前人研究表明适宜浓度的乙烯利喷施可显著提高银杏萜内酯含量，200 mg·L-1时达到最大值，为对照的2.11倍[14]。10 mmol·L-1的乙烯利也被证明可促进银杏萜内酯的积累，在喷施第8天时，与对照组相比提高了10.20%[15]。以往研究均为盆栽试验，且未深入探讨萜内酯各组分变化。有关较高浓度乙烯利处理银杏的研究也鲜有报道，为此笔者对银杏大田实生苗进行乙烯利浓度梯度喷施处理，分析银杏叶生物量、生理指标对不同外源乙烯利浓度的响应以及不同浓度乙烯利处理下叶萜内酯含量的变化，研究外源乙烯利浓度对银杏叶生物量、生理及品质的影响及作用机制，以期为叶用银杏林高产提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于江苏省徐州市邳州市四户镇（117°55′E，34°37′N）。该镇位于邳州市北部边缘，苏鲁交界处，属黄淮冲积平原，地势平坦，平均海拔31 m。属暖湿带湿润半湿润季风气候区，四季分明，日照充足，冬干冷，夏温热，年平均气温14 ℃，年平均降水量868 mm。

试验地为优质叶用银杏林，土壤肥力适中，排水良好。银杏均为3年生实生苗，平均苗高1.8 m，平均地径21 mm，株行距1.2 m，株间距0.5 m。试验地管理栽培措施到位，银杏苗生长健壮且无病虫害。

1.2 试验设计

2022年8月初在研究区进行区组划分，采用完全随机区组试验设计，每种浓度设置3次重复。每个小区划分面积为6 m2，选择其中3株银杏苗进行处理，共15个小区。各小区间设置两列作为保护行。乙烯利处理设置4个浓度梯度，共计5个处理（表1）。乙烯利（40%的水剂）由四川国光农化股份有限公司生产。试验采用叶面喷施，使用前稀释至相应浓度。其中吐温80（0.1%，V/V）作为一种非离子型表面活性剂，有助于乙烯利更好地被植株吸收。喷施时间选在晴天无风的上午进行。喷施时以叶片正反面均布满液滴为标准，每株苗喷施量约100 mL。

黄小花等[16]研究发现银杏各萜内酯含量最大值的出现时间集中在9月；戚向阳等[17]对来自不同产地、不同季节的银杏叶样品进行检测分析，得出银杏叶的最佳采收季节为9—10月。根据谢宝东等[14]的研究，3年生银杏实生苗对乙烯利的响应时间约30 d。因此试验设计于2022年8月7日（叶色转黄初期）喷施一次，30 d后采样。

1.3 样品采集与处理

每个小区的3株苗记录叶生物量并混样。每个小区的样品随机分为2份：一份迅速放入自封袋置于干冰中，带回试验室-80 ℃下储存，用于测定叶绿素、初生代谢物及内源激素等生理指标。另一份置于冰盒中，带回实验室后放入信封于105 ℃杀青10 min后，60 ℃烘至恒质量、粉碎，干燥器贮存。每个处理（3个重复）精准称取1 g干燥粉末后用9 cm双圈定性滤纸包好，供测定萜内酯。

1.4 指标测定

1.4.1 叶生理指标

叶绿素含量的测定采用无水乙醇浸提法；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法；均参照王学奎等[18]主编的植物生理生化实验原理和技术。

1.4.2 叶内源激素含量

将冰箱中的叶片取出，用液氮研磨至粉碎。后用千分之一的天平精准称取0.5 g置于离心管中，每个处理重复3次。采用酶联免疫法[19]测定银杏叶片中赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）、生长素（IAA）和玉米素（ZR）4种激素的含量。

1.4.3 叶萜内酯含量

参照中国药典[20]测定银杏内酯A、B、C及白果内酯的含量。采用高效液相色谱法（HPLC），参数设置参照文献[21]，以甲醇和纯水（31∶69）为流动相，柱温35 ℃，流速1 mL·min-1，漂移管温度90 ℃，雾化气体压力42.5 psi，上样体积20 μL。

测定方法：设置5个梯度浓度的混标溶液，与样品上样量相同，测定后根据峰面积和浓度建立线性回归方程，分别计算银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯BB的含量，银杏总萜内酯含量=银杏内酯A+银杏内酯B+银杏内酯C+白果内酯。

1.5 数据处理和分析

采用Excel 2016和SPSS 26.0软件对试验数据进行处理和统计分析，采用单因素方差分析和Duncan多重比较对不同浓度处理间进行显著差异检验（P=0.05），对萜内酯各组分和相关指标进行斯皮尔曼相关性分析，主成分分析及综合评价方法参照文献[22-23]。

2 结果与分析

2.1 乙烯利对银杏叶生物量的影响

不同浓度乙烯利处理对银杏叶生物量的影响见表2。随着乙烯利浓度的升高，银杏叶生物量呈先升高后降低的趋势，在400 mg·L-1乙烯利处理下达到最大值，比对照组高63.65 g，说明该浓度的乙烯利处理对银杏叶生物量的积累有一定促进作用。800 mg·L-1的乙烯利处理组叶生物量低于对照组但未达到显著影响（P>0.05），说明高浓度的乙烯利处理对3年生银杏大田实生苗叶片的生长有一定的抑制作用。

2.2 乙烯利对银杏叶叶绿素含量的影响

不同浓度乙烯利处理后，银杏叶叶绿素含量及多重比较结果见表3。随着乙烯利浓度提高，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素及总叶绿素含量均呈先升高后降低的趋势，400 mg·L-1处理组均达到最大值，分别为5.70、2.83、1.66和8.53 mg·g-1。800 mg·L-1处理组叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量及总叶绿素含量均高于对照组，但未达到显著差异水平（P>0.05）。

2.3 乙烯利对银杏叶初生代谢物的影响

不同浓度乙烯利处理后，银杏叶可溶性糖、可溶性蛋白质含量及多重比较结果见表4。总体上，外源乙烯利对可溶性糖及蛋白含量无显著影响（P>0.05），但均高于对照组。200 mg·L-1乙烯利处理组可溶性糖和可溶性蛋白的含量最高，分别为6.96和1.35 mg·g-1。随着乙烯利浓度的升高，可溶性糖和可溶性蛋白含量呈降低趋势，在800 mg·L-1处理组又分别升高至6.76和1.31 mg·g-1。

2.4 乙烯利对银杏叶内源激素的影响

不同浓度乙烯利处理后，银杏叶内源激素含量及多重比较结果见表5。乙烯利处理不同程度地影响了GA3、ABA、IAA和ZR的含量。除600 mg·L-1处理组外，其余处理组GA3含量均显著高于对照（P<0.05），分别是对照组的1.10、1.50和1.14倍。600和800 mg·L-1处理组ABA含量均显著高于对照（P<0.05），分别提高了18.50%和11.82%。IAA和ZR的含量随乙烯利浓度的提高未呈现规律性变化。

2.5 乙烯利对银杏叶萜内酯各组分含量的影响

不同浓度乙烯利处理后，银杏叶GA、GB、GC、BB及总萜内酯的含量及多重比较结果见表6。800 mg·L-1的乙烯利处理显著提高了银杏叶中总萜内酯的含量（P<0.05），与对照组相比提高了13.43%；低浓度乙烯利（<500 mg·L-1）处理对GA影响不显著（P>0.05），600、800 mg·L-1的乙烯利处理下GA含量分别为1.95±0.17、2.26±0.02 mg·g-1，是对照组的1.10倍和1.28倍。除600 mg·L-1处理组外，其他浓度处理组的GB含量均显著高于对照组（P<0.05），尤其是400 mg·L-1的乙烯利处理后，GB含量提高了84.13%。乙烯利处理对GC含量的影响均不显著（P>0.05），但显著降低了BB的含量（P<0.05）。

2.6 萜内酯各组分与生理指标的相关性分析

不同浓度乙烯利处理后，银杏叶萜内酯与部分生理指标的相关性（r值）分析结果见表7。喷施乙烯利后GA含量与叶绿素a、总叶绿素显著负相关（P<0.05），与类胡萝卜素呈极显著负相关（P<0.01）。GB含量与ABA显著正相关（P<0.05），与IAA、GA3、ZR显著正相关（P<0.05）。GC、BB含量与ZR显著正相关（P<0.05）。

2.7 综合评价

3 结论与讨论

3.1 讨 论

萜类化合物是以异戊二烯为结构单元组成的化合物的统称，半数以上存在于高等植物中，如银杏、红豆杉和人参等[24]。由于广泛的药理活性，萜类化合物具有较高的经济价值。乙烯利作为一种植物生长调节剂，能够正向调控多种植物萜内酯化合物的合成与积累，如5%乙烯利喷施处理药用植物绞股蓝Gynostemma pentaphyllum，可显著增加除茎以外各器官中总皂苷的含量[25]；对长春花Catharanthus roseus喷施0.1 mmol·L-1的乙烯利，72 h后叶片中长春碱的含量提高了91%[26]；红豆杉Taxus cuspidata细胞悬浮培养时，随着乙烯利浓度的提高，细胞的生长量和紫杉醇的总产量也逐渐增大[27]。本研究与前人研究结果一致，乙烯利处理显著提高了银杏叶总萜内酯含量。相关研究结果表明，喷施乙烯利后银杏中GbDXS、GbGGPPS、GbLPS和GbMVD等萜内酯合成途径关键酶基因均响应，这说明乙烯利通过上调部分关键酶基因表达水平进而影响萜类化合物的合成[15，28]。

植物初生代谢物是植物生长发育及生命维持不可或缺的，包括糖类、脂类、蛋白质等。次生代谢物是植物为了抵御环境胁迫而产生的一大类小分子物质，由初级代谢产物衍生而来[29]。本研究中，不同浓度的乙烯利处理均提高了可溶性糖和蛋白含量，这说明适宜浓度的乙烯利处理能够促进其积累，为次生代谢提供更丰富的底物。但随着乙烯利浓度的升高，可溶性糖和可溶性蛋白未呈现有规律的变化，这可能与浓度梯度设置过大有关。外源激素对植物次生代谢的影响往往不是单独起作用，而是与其他激素协同交互共同作用于次生代谢物的积累[24]。本研究中，800 mg·L-1乙烯利的喷施有利于内源GA3和ABA含量的增加，这与许锋等[30]研究发现一年中银杏总萜内酯含量与GA3、ABA含量变化相一致，说明乙烯利是通过调节内源激素来影响次生代谢。此外，在本研究中IAA、ZR随乙烯利浓度的增加未呈现有规律的变化，可能与复杂的激素作用机制相关。

总体而言，乙烯利处理均提高了银杏叶片中GA、GB的含量，但不同程度地降低了BB含量，这可能是由于白果内酯和银杏二萜内酯有着不同的合成路径[31]。王鼎豪[19]的研究也发现不同激素处理对银杏萜内酯各组分含量影响各不相同。相关性分析结果表明，银杏萜内酯各组分含量与各生理指标呈现不同程度的变化，为了更好地分析各生理指标的综合效益，采用主成分分析法提取了2个主成分，进行综合排名，结果表明外源乙烯利浓度为800 mg·L-1时处理的综合得分排名最高，该处理能够有效增加银杏叶生物量，促进银杏叶片中初生代谢物的积累，有效调节各激素的含量，提高银杏萜内酯及各组分的含量。由于乙烯利在气温高于20 ℃、pH值>4.1的条件下才能更好地释放乙烯，因此植株生长状态、药剂浓度、喷施剂量及施用时间的不同均会影响乙烯利的施用效果。因此，在实际生产中需要根据情况确定最佳的喷施浓度，为叶用银杏林创造更大的经济价值。

本研究重点关注银杏大田实生苗银杏叶生物量、生理及品质对外源乙烯利的响应，得出了有利于银杏萜内酯含量积累的适宜外源激素施用浓度，为叶用银杏林中乙烯利的施用提供了参考。目前，喷施外源乙烯利以促进次生代谢的相关研究还比较少，乙烯利对银杏萜内酯含量影响的分子机制有待于进一步深入研究。

3.2 结 论

不同浓度乙烯利处理下，银杏叶生物量增加（800 mg·L-1处理组除外），叶绿素含量、可溶性蛋白和可溶性糖含量不同程度增加。800 mg·L-1乙烯利处理组银杏总萜内酯含量显著增加，GA3和ABA含量显著增加。银杏对不同乙烯利浓度的响应存在差异，通过主成分分析并结合综合评价，4种乙烯利浓度处理对调控银杏叶生物量、生理和品质的综合排名由大到小依次为800>600>400>200>0 mg·L-1。

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[本文编校：吴 彬]