“红阳”猕猴桃根际土壤细菌的分离与鉴定

引用格式：瞿昕怡，彭清忠，向小奇，等. “红阳”猕猴桃根际土壤细菌的分离与鉴定[J]. 湖南农业科学，2024（6）：5-9.

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2024.006.002

收稿日期：2023-12-28

基金项目：湖南省重点研发计划（2022NK2055）；湖南省大学生创新训练计划项目（S202310531067）

作者简介：瞿昕怡（2002—），女，湖南株洲市人，本科生，研究方向为微生物生态学。

通信作者：易浪波

摘要：为探明健康与感病“红阳”猕猴桃根际土壤的细菌种群差异，从湘西州保靖县猕猴桃种植区采集健康与感病2种根际土壤样品，通过纯培养法分离细菌，基于细菌菌落形态特征和16S rRNA基因序列的系统发育分析进行种属鉴定。从2种根际土壤样品中共分离获得30株细菌，经鉴定分属于链霉菌属、红球菌属、芽孢杆菌属、北里孢菌属和节杆菌属5个属；健康猕猴桃根际土壤中优势菌群为芽孢杆菌属和链霉菌属；感病猕猴桃根际土壤中主要是芽孢杆菌属细菌，且没有分离到北里孢菌属细菌。这表明健康与感病“红阳”猕猴桃根际土壤中细菌在种属水平存在差异，推测链霉菌属细菌中可能存在拮抗溃疡病的菌株。

关键词：猕猴桃；根际土壤；可培养细菌；分离；鉴定

中图分类号：S436.634 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2024）06-0005-05

Isolation and Identification of Bacteria from Rhizosphere Soil of the Kiwifruit Variety 'Hongyang'

QU Xin-yi，PENG Qing-zhong，XIANG Xiao-qi，YI Lang-bo

（College of Biology and Environmental Sciences， Jishou University， Jishou 416000， PRC）

Abstract： This study aims to reveal the differences of rhizosphere soil microorganisms between the healthy and diseased plants of the kiwifruit variety 'Hongyang'. Rhizosphere soil samples of the healthy and diseased plants were collected from the kiwifruit planting area of Baojing County， Xiangxi Prefecture， and bacteria were isolated by the pure culture method. The isolates were identified by morphological observation of colonies and phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences. A total of 30 bacterial strains were isolated from two kinds of soil samples， and they were identified as Streptomyces， Rhodococcus， Bacillus， Kitasatospora， and Arthrobacter. Bacillus and Streptomyces were the dominant bacteria in the rhizosphere soil of healthy kiwifruit plants. Bacillus was dominant and Kitasatospora was not discovered in the rhizosphere soil of diseased kiwifruit plants. The results demonstrated differences of bacteria genera in the rhizosphere soil between healthy and diseased plants of the kiwifruit variety 'Hongyang'， which indicated that there might be antagonistic strains of Streptomyces against kiwifruit canker.

Key words： kiwifruit; rhizosphere soil; culturable bacteria; isolation; identification

猕猴桃细菌性溃疡病是严重威胁猕猴桃生产和发展的典型病害[1]，其病原菌为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）[2-3]。猕猴桃溃疡病的发病特点是蔓延速度快，严重时能覆盖整个种植园区，造成巨大的经济损失，极大地限制了猕猴桃产业的发展。目前针对溃疡病这一毁灭性的病害，主要防治措施有农业防治[4]、化学防治和生物防治等。在化学防治过程中，长期使用同类农药会使病菌产生一定抗性，导致药效下降，且化学药剂的长期使用容易造成重金属污染和抗生素残留，危害生态环境和人类健康。生物防治是将一株或几株特殊菌株制成单菌剂或者混合菌剂，用于降低植物发病率，控制病害程度[5]。生物防治具有环境友好、人畜安全、可持续性、特异性强等特点，符合人们对绿色防治的需求，因而受到众多学者青睐[6]。

根际是植物、土壤、微生物3者相互作用的场所，亦是各种有益或有害物质进入根系参与物质循坏的门户[7]。根际微生物是土壤的重要组分，其种类丰富，可分泌大量代谢物质，影响土壤理化性质的同时也影响植物的生长发育、抗逆和抗病性等[8]。因此，根际土壤细菌种群结构和多样性是猕猴桃防病治病研究的重点领域之一。

湘西土家族苗族自治州（以下简称“湘西州”）由于其得天独厚的地理位置和气候条件，是我国猕猴桃的重点产区之一，被称为中南地区“猕猴桃之乡”。2021年，湘西地区猕猴桃的种植面积约为1.33万hm2，猕猴桃产业成为推动湘西地区经济发展的支柱产业之一[9]。保靖县是湘西州主要的猕猴桃种植基地之一，近年该县的“红阳”猕猴桃园大规模暴发溃疡病，严重影响当地猕猴桃的产量与质量。鉴于此，该研究对健康和感病“红阳”猕猴桃根际土壤细菌进行分离，基于细菌形态特征和分子生物学方法对菌株进行鉴定，并分析健康和感病猕猴桃根际土壤的微生物多样性，探明“红阳”猕猴桃根际土壤细菌的种群差异，为猕猴桃溃疡病生物防治菌剂的研发提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在湘西州保靖县猕猴桃基地（110°4′E，28°54′N）

采集猕猴桃根际土壤样品，用五点取样法确定采样植株，采集健康和感病猕猴桃植株根际土壤样品各5份。将5份健康植株的土样充分混合，记为A组；将5份感病植株的土样充分混合，记为B组；土样采集后置于4℃冰箱中保藏备用。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的配制 （1）LB液体培养基：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0。（2）LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上，加入琼脂10～15 g。（3）高氏一号培养基：可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，水1 000 mL，pH值7.0。

1.2.2 菌株分离与纯化 称取A、B 2组土壤样品各5 g，分别加到装有50 mL无菌水的三角瓶中，置于25℃、转速150 r/min条件下振荡30 min。每组设置3个平行样，稀释100倍后吸取样品溶液各200 μL涂布于不同培养基上，25℃恒温培养2～4 d。记录各培养基上细菌群落生长数量，并挑取单菌落接种至LB固体培养基，通过平板划线法纯化3代。将纯化后的菌株接种至LB液体培养基中，在25℃、转速180 r/min条件下摇床培养1～2 d，待培养液混浊或出现明显絮状物后，吸取培养液0.5 mL加入1.5 mL离心管中，再加入0.5 mL 40%甘油，混匀后用封口膜密封，置于-80℃冰箱中保存。

1.2.3 菌株DNA的提取 取出保存于-80℃冰箱中的A、B组菌株，于LB固体培养基中通过平板划线法纯化培养，挑取单菌落于LB液体培养基中培养1～2 d，得到菌悬液。采用细菌基因组DNA快速提取试剂盒，按照操作手册进行菌株DNA的提取，提取

的DNA立即进行下一步试验或于-20℃冰箱中保存。

1.2.4 菌株的16S rRNA基因扩增测序及系统发育分析 以A、B组菌株的基因组DNA为模板，分别配置50 µL PCR反应体系，其中2×Taq PCR Mix 25 µL，

细菌通用引物PA（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

-3'）和PB（5'-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3'）各1

µL，基因组DNA模板2 µL，Taq酶1 µL，再加双蒸水补齐至50 µL。充分混匀放入PCR仪，进行16S rRNA基因片段扩增。PCR程序为：95℃预变性2.5 min；95℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。运用NCBI中Blast工具进行同源序列比对，得到与菌株相似度高的菌属，并从中选出相似度最高的9株，下载其16S rRNA序列，构建系统发育树，再根据同源性大小和系统发育关系进行菌株鉴定。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离与形态特征记录

通过纯培养法，从A、B组中分离出多株细菌，根据菌落形态和细胞显微形态特征去冗余，最终从根际土壤A、B组中各选取15株代表性菌株，分别记录为a1～a15和b1～b15。将分离菌株接种于LB固体培养基中划线培养长出单菌落，记录菌株的形态特征（图1和表1）。

2.2 细菌类群鉴定

分别提取分离A、B组菌株的基因组DNA，经PCR扩增获得序列长度约1.5 kb的16S rRNA基因片段，电泳图见图2、图3。

将测定序列提交至GenBank进行Blast同源性比对，构建系统发育树确定菌株的分类学地位。结果表明，30株细菌主要分为5大类，其16S rRNA基因序列分别与链霉菌属（Streptomyces）、红球菌属（Rhodococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、北里孢菌属（Kitasatospora）和节杆菌属（Arthrobacter）的同源性高达99%以上，种属鉴定的可信度较高。由表2可知，A组有6株属于芽孢杆菌属，5株属于链霉菌属，2株属于红球菌属，1株属于北里孢菌属，1株属于节杆菌属；B组有10株属于芽孢杆菌属，2株属于红球菌属，2株属于节杆菌属，1株属于链霉菌属。

2.3 菌株的多样性对比

由表2可知，在健康与感病猕猴桃根际土壤分离纯化得到的30株菌株中，芽孢杆菌属、链霉菌属、红球菌属、节杆菌属和北里孢菌属分别占比53.34%、20.00%、13.33%、10.00%和3.33%，其中芽孢杆菌属为优势菌属。在健康猕猴桃根际土壤分离纯化得到的15株菌株中，5个属的占比从高至低依次为芽孢杆菌属（40.00%）、链霉菌属（33.33%）、红球菌属（13.33%）、北里孢菌属（6.67%）和节杆菌属（6.67%），其中芽孢杆菌和链霉菌为优势菌群。在感病猕猴桃根际土壤分离纯化得到的15株菌株中，4个属的占比从高至低依次为芽孢杆菌属（66.67%）、红球菌属（13.33%）、节杆菌属（13.33%）、链霉菌属（6.67%），其中芽孢杆菌为优势菌群。

由PAST 4.03软件进行数据处理，利用多样性指数分析比较健康与感病猕猴桃根际细菌多样性的差异。在α多样性分析中，Chao1指数反映群落的丰富度，其指数越大，说明该群落丰富度越高；香农指数和辛普森指数反映群落多样性，其指数越大，说明该群落多样性越高。由表3可知，健康猕猴桃根际土壤中细菌的多样性高于感病猕猴桃根际土壤。

3 讨论与结论

根际的范围一般指包围根表面几毫米范围内的区域，这一区域同时受到根系、土壤、微生物等的共同作用[10]。在根际微生物中，细菌最常见。近年来，利用土壤中的有益细菌防治植物病害成为国内外研究的热点[11]。盛存波等[12]从陕西省猕猴桃果园根际土壤中分离获得对猕猴桃溃疡病菌有抑制作用的芽孢杆菌B56-3；邵宝林等[13]从四川省猕猴桃根际土壤中筛选出对猕猴桃溃疡病菌有拮抗效果的芽孢杆菌B2；张钟月[5]从健康与感病猕猴桃根际土壤分离出寡养单胞菌属等27个菌属。

该研究在湘西州保靖县的猕猴桃种植区采集健康和感病猕猴桃植株根际土壤，从中筛选出菌落形态特征差异较大的30株菌株，经测序和系统进化分析，初步鉴定30株菌株分别属于芽孢杆菌属、链霉菌属、红球菌属、节杆菌属和北里孢菌属5个属，表明猕猴根际土壤细菌具有丰富的物种多样性，这些菌种极大地丰富了猕猴桃溃疡病生物防治的微生物种质资源。

此外，该研究筛选的30株菌株中芽孢杆菌属有16株，占比达53.34%，可推断其为猕猴桃植株根际土壤的优势菌属。比较健康和感病猕猴桃根际土壤细菌菌群发现：链霉菌属菌株在健康植株根际土壤占比（33.33%）明显高于在感病植株根际土壤中的占比（6.67%），且在健康猕猴桃根际土壤中属于优势菌群之一，由此推测链霉菌属在猕猴桃根际土壤的分布差异可能是影响猕猴桃植株健康或感病的原因之一。王芳等[15]发现，链霉菌SY-L12对猕猴桃溃疡病菌有拮抗作用，因此可进一步研究健康猕猴桃根际土壤分离出的链霉菌中是否存在拮抗溃疡病的菌株，以期为猕猴桃细菌性溃疡病的生物防治提供菌种资源。

参考文献：

[1] 李黎，钟彩虹，李大卫，等. 猕猴桃细菌性溃疡病的研究进展[J]. 华中农业大学学报，2013，32（5）：124-133.

[2] 王涛，张计育，王刚，等. 猕猴桃细菌性溃疡病研究进展[J]. 中国农学通报，2020，36（3）：123-128.

[3] 游雨欣，戴德江，罗金燕，等. 猕猴桃溃疡病防治策略的研究现状与展望[J]. 浙江农业科学，2022，63（6）：1322-1328，1331.

[4] 李娟. 陕西猕猴桃常见病害生物防治技术及田间应用[D]. 西安：西北大学，2010.

[5] 张钟月. 患溃疡病或正常猕猴桃内生及土壤细菌多样性及群落结构研究[D]. 雅安：四川农业大学，2018.

[6] 王超，郭坚华，席运官，等. 拮抗细菌在植物病害生物防治中应用的研究进展[J]. 江苏农业科学，2017，45（18）：1-6．

[7] 张利，邱松，刘建霞，等. 植物根际土壤生态研究进展[J]. 四川农业科技，2021（7）：39-40.

[8] 王雪峰，毛之夏，徐济责，等. 根际效应对大豆田土壤线虫群落组成及多样性的影响[J]. 生态学报，2016，36（16）：5256-5262.

[9] 马幸幸，王元顺，卜范文，等. 湘西州猕猴桃产业发展现状及种质资源保存概况[J]. 南方农业，2021，15（32）：197-199.

[10] 连文慧，董雷，李文均. 土壤环境下的根际微生物和植物互作关系研究进展[J]. 微生物学杂志，2021，41（4）：74-83.

[11] 周阳薇，刘正坪，魏艳敏，等. 植物根际土壤细菌的分离与鉴

定[J]. 中国农学通报，2015，31（7）：212-217.

[12] 盛存波，安德荣，鲁燕汶，等. 一株抗猕猴桃溃疡病的芽孢杆菌分离和筛选研究初报[J]. 中国农学通报，2005，21（12）：346-348.

[13] 邵宝林，王成华，刘露希，等. 猕猴桃溃疡病生防芽孢杆菌B2的鉴定及应用[J]. 中国农学通报，2015，31（26）：103-108.

[14] 盛存波. 陕西猕猴桃细菌性溃疡病的生物防治初步研究[D]. 咸阳：西北农林科技大学，2006.

[15] 王芳，李丹，张信旺，等. 一株链霉菌对猕猴桃溃疡病的防效[J]. 北方园艺，2017（7）：139-142.

（责任编辑：王婷）