汝州市犬细小病毒的PCR检测及VP2基因序列分析

摘" 要：为了解汝州市犬细小病毒的流行和变异情况，本研究调查了汝州市3家动物诊所接诊的20例疑似感染犬细小病毒病例。PCR结果显示，15份样本为犬细小病毒阳性。VP2蛋白氨基酸序列分析结果显示：12株犬细小病毒的基因亚型为CPV-2c，3株犬细小病毒的基因亚型为CPV-2a；分离得到的15株犬细小病毒其氨基酸序列同源性为99.1％～100.0％，与疫苗株的同源性为97.5％～98.6％，与其他国内外参考毒株的同源性为98.0％～100.0％；分离的12株CPV-2c型毒株与我国广西等地分离的CPV-2c型毒株具有较近的亲缘关系；分离的3株CPV-2a型毒株与我国广州等地分离的CPV-2a型毒株属于同一支。对汝州市犬细小病毒的流行调查，为该地区犬细小病毒病的防控提供了理论基础。

关键词：犬细小病毒；VP2基因；检出率；进化分析

基金项目：河南省本科高校青年骨干教师培养计划项目（项目编号：2023GGJS178）

作者简介：雷晨昱（1982－ ），女，助教，硕士，主要研究方向为动物疫病病原分子免疫；E-mail：toffee.lei@163.com

犬细小病毒是一种经粪-口途径传播的、致犬发生胃肠道和心肌疾病的病原体[1]。犬细小病毒自20世纪70年代后期出现以来，在全球范围内持续传播[2]。目前，我国大部分城市的犬细小病毒病得到了有效的控制，但在县城或乡镇，该病在幼犬和青年犬上仍频繁发生，甚至在接种过疫苗的犬上也有发生，严重影响当地宠物经济的发展[3]。

犬细小病毒（canine parvovirus，CPV）属于细小病毒科原细小病毒属，基因全长5 323 bp，有2个开放阅读框，共编码4种蛋白。第一个开放阅读框编码NS1和NS2两种非结构蛋白，NS1蛋白是病毒DNA复制的前提，NS2蛋白促进病毒颗粒从细胞中释放；第二个开放阅读框编码VP1和VP2两种结构蛋白，VP2蛋白包含在VP1蛋白中，VP3蛋白是由VP2蛋白在酶作用下裂解形成[2]。犬细小病毒的核衣壳由VP1蛋白和VP2蛋白共同组成，VP2蛋白是犬细小病毒的关键区域，与犬细小病毒颗粒的感染性、血凝性等密切相关，其关键碱基和氨基酸序列的变化可能导致病毒发生变异[4]。犬细小病毒为单股线状DNA病毒，易发生突变，经过这些年的进化，形成了CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、New CPV-2a、New CPV-2b等新的基因型[5]。1983年，徐汉坤等[6]首次报道了犬细小病毒性肠炎，之后犬细小病毒病开始在我国流行。目前CPV-2a和CPV-2b是我国比较流行的毒株[7]。另外，关于New CPV-2a毒株的报道增多，该毒株毒力强并且传播速度快[7]。目前，犬细小病毒在中国宠物临床上呈现多重感染的情况。

近年来，关于犬细小病毒流行病学调查的研究不多，为了解汝州市犬细小病毒的流行毒株和变异情况，本研究从该地区3家动物诊所收集有腹泻、呕吐症状病犬的既往病历信息，分析检出率；扩增VP2基因，进行测序和同源性分析。从宏观水平和分子水平，对汝州市犬细小病毒的流行特点和分子特征进行监测和评估，以期为该地区犬细小病毒病的防控提供理论基础。

1" 材料与方法

1.1 调查对象和方法

汝州市3家动物诊所作为调查地点，诊所接收的20只有腹泻、呕吐症状的疑似患犬细小病毒病的犬作为调查对象，采集犬粪便或肛门拭子。

1.2 主要仪器和试剂

PCR扩增仪购自赛默飞世尔科技公司。TGel蓝光凝胶成像系统购自天根生化科技有限公司。病毒DNA/RNA基因组快速提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。2×Taq PCR Master Mix购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 病毒基因组DNA提取

按照病毒DNA/RNA基因组快速提取试剂盒操作说明，对粪便样本进行DNA提取，－20 ℃保存。

1.4 引物合成

根据GenBank公布的VP2基因序列，设计2对引物（表1），引物CPV-1F和CPV-1R用于犬细小病毒的常规检测；引物C-VP2-2F和C-VP2-2R用于CPV VP2基因全序列扩增。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.5 样本PCR检测

PCR反应体系为：样本DNA 1.0 μL、引物各0.4 μL、2×Taq PCR Master Mix 10.0 μL、ddH2O 7.2 μL，总反应体系20.0 μL。反应条件：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 40 s，40个循环，72 ℃ 7 min；4 ℃保存。取6 μL PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳。

1.6 VP2基因扩增和测序

PCR反应体系同1.5步骤。反应条件：预变性95 ℃ 2 min，变性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 90 s，35个循环，72 ℃ 12 min；4 ℃保存。将PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳。将扩增产物送至苏州金唯智生物科技有限公司（天津分公司）测序。

1.7 CPV VP2氨基酸序列分析

使用DNAStar（EditSeq）将基因序列翻译为氨基酸序列，与GenBank上已发布的30株国内外犬细小病毒（16株国内分离的CPV-2c型、CPV-2a型、New CPV-2a型和CPV-2b型毒株，11株国外分离的CPV-2c型和CPV-2b型毒株，3株商品化疫苗株）的氨基酸序列进行对比分析。使用DNAStar对氨基酸序列进行同源性比较，分析氨基酸变异情况，确定分离的CPV毒株基因型[8]。使用MEGA-X-10.0.5绘制系统进化树。

2" 结果

2.1 犬细小病毒检出率

PCR结果显示，20个样本中有15个扩增出特异性条带，片段大小与预期结果一致。测序为VP2基因，检出率为75％。

2.2 VP2基因扩增结果

以部分阳性样本为模板进行VP2基因全序列扩增，大小为1 755 bp。结果显示，目的条带大小与预期结果一致。

2.3 毒株亚型分析

将15株犬细小病毒分离株的VP2基因序列翻译成氨基酸序列，详细命名见表2。参考犬细小病毒分型标准，确定CPV-RZ-02、CPV-RZ-03、CPV-RZ-15毒株297位氨基酸为S，426位氨基酸为N，属于CPV-2a亚型；CPV-RZ-01、CPV-RZ-04、CPV-RZ-05、CPV-RZ-06、CPV-RZ-07、CPV-RZ-08、CPV-RZ-09、CPV-RZ-10、CPV-RZ-11、CPV-RZ-12、CPV-RZ-13、CPV-RZ-14毒株出现了370 （Q→R）、426（N→E）、440（A→T）氨基酸突变，属于CPV-2c亚型。

2.4 VP2主要氨基酸位点突变分析

从表2可以看出，与CPV-2c参考株（MH660525）相比，12株CPV-2c亚型分离株相对较为保守，VP2蛋白的氨基酸序列没有发生突变。CPV-RZ-02、CPV-RZ-03、CPV-RZ-15除关键位点发生了突变外，与参考株（M24003）相比，还存在氨基酸突变，有D511E处突变。

2.5 同源性分析

结果表明，15株犬细小病毒分离株间的氨基酸同源性在99.1％～100.0％，分离株与疫苗株的氨基酸同源性在97.5％～98.6％，与国内16株犬细小病毒的氨基酸同源性在98.6％～100.0％，与境外11株犬细小病毒的氨基酸同源性在98.0％～100.0％（图1）。

2.6 系统进化树分析

采用MEGA-X-10.0.5软件构建VP2蛋白氨基酸的遗传进化树，由图2可知，CPV-RZ-01、CPV-RZ-04、CPV-RZ-05、CPV-RZ-06、CPV-RZ-08、CPV-RZ-09、CPV-RZ-10、CPV-RZ-11、CPV-RZ-12、CPV-RZ-14、CPV-RZ-15、CPV-RZ-17与我国广西、黑龙江、沈阳等地分离的CPV-2c型毒株的亲缘关系比较近，与乌拉圭、西班牙、克罗地亚、意大利分离的CPV-2c型毒株不属于同一支；CPV-RZ-02、CPV-RZ-03、CPV-RZ-20与我国广州、哈尔滨等地分离的CPV-2a型毒株属于同一支；15株分离株与3株疫苗株属于不同的分支，亲缘关系较远。

3" 讨论

虽然临床上CPV-2型疫苗被广泛使用，但是变异株仍在犬科动物间变异、传播[9]。本试验从河南省汝州市3家动物门诊的15份样本中扩增得到12株CPV-2c亚型毒株，3株CPV-2a亚型毒株。2020年，韩国首次报道了CPV-2c亚型，现阶段全球多数地区均有CPV-2c亚型的报道[10]。2010年以前，我国主要流行CPV-2a亚型[11]，之后，我国广西、吉林、北京[12]等地发现CPV-2c亚型。本试验从河南省汝州市检测到的毒株主要是CPV-2c亚型，说明该地区主要流行CPV-2c亚型，这为该地区犬细小病毒病的防控提供了理论基础。

VP2基因是犬细小病毒的重要毒力基因，决定着病毒的抗原性、血凝性和宿主范围[13]。本试验以15份样本为模板分别扩增VP2基因，序列比对结果显示与GenBank已发布VP2基因序列的同源性都在99％以上。氨基酸序列比对显示，CPV-RZ-02、CPV-RZ-03、CPV-RZ-15毒株有D511E处突变，可能是由境外传入或是现有基因型进化而来。在意大利和尼日利亚的报道中，描述到亚洲存在一种以VP2蛋白中存在特定氨基酸残基（5Gly、267Tyr、324Ile、370Arg）为特点的CPV-2c基因组变体[14-15]，并在上海的报道中描述过该特征的变异毒株[16]，这与我们得出的结果一致，证明在河南省汝州市流行的CPV-2c毒株是亚洲新的CPV-2c变异毒株。通过系统发育进化树分析可知，犬细小病毒在进化中形成了不同的分支，检测的CPV-2c亚型毒株与乌拉圭、西班牙、克罗地亚、意大利的6株CPV-2c亚型毒株不在同一分支上，与国内的CPV-2c亚型毒株亲缘关系近，与李少晗等[17]在北京的调查结果一致。林瑜婷等[4]在对河南方城县的调查中发现，该地区已出现CPV-2c亚型的突变毒株，结合本试验结果表明，CPV-2c亚型的突变毒株是该地区主要流行的毒株。这对河南省使用CPV-2型疫苗对新的CPV-2c亚型突变毒株保护效果的评估很重要。此外，应加强河南省犬细小病毒变异情况的流行病学调查，特别是对CPV-2c亚型的监测，对实时调整河南省犬细小病毒病的防控措施有重要意义。

4" 结论

对犬细小病毒VP2基因序列分析发现，汝州市主要流行CPV-2c亚型毒株，该毒株属于亚洲CPV-2c亚型的变异毒株，具体情况还需要进一步研究。本调查了解了河南省汝州市犬细小病毒的流行情况，充实了河南省犬细小病毒的流行信息，为该地区犬细小病毒病的防控工作提供了理论依据。

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