河南省部分地区猪源大肠杆菌耐药基因floR、CTX－M、mcr－1 的分子流行病学调查

赵公锦彭 丽方忠意吴宁鹏李金磊李 孟吴志明∗

（1． 河南农业大学牧医工程学院，郑州450002；2． 河南省兽药饲料监察所，郑州450008）

大肠杆菌病是猪群中常见的细菌性疾病，是危害仔猪健康的重要传染病之一。 目前防治该病的主要手段是使用抗菌药物，但由于不规范或滥用抗菌药物现象的存在，导致细菌的耐药现象越来越严重。 动物源耐药菌的大量出现与广泛流行，不仅影响到畜禽养殖业的持续健康发展，更严重威胁公共卫生安全。 氟苯尼考、头孢噻呋、粘杆菌素是兽医临床治疗大肠杆菌病的常用药物。 大肠杆菌对氟苯尼考、头孢噻呋、粘杆菌素的主要耐药基因分别为floR、CTX－M、mcr－1，都是通过质粒在细菌中间进行水平转移的耐药基因［1－3］，对于传播大肠杆菌耐药性具有很大的风险。 本研究对2013 －2018年河南省猪源大肠杆菌耐药基因floR、CTX－M、mcr－1 的分布特征及流行规律进行了调查，旨在了解河南省猪源大肠杆菌的耐药现状，进一步探索认识其分子流行规律，从而保障公共卫生安全和生态环境安全。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 菌株 856 株样本来自2013 －2018 年河南省郑州、开封、焦作、许昌四个地区规模化养殖场健康猪的肛门拭子，由河南省兽药饲料监察所分离保存。 大肠杆菌质控菌株ATCC 25922，购自中国兽医药品监察所。

1．1．2 试剂耗材 营养琼脂，购自北京陆桥技术股份有限公司；PCR 预混酶，购自康为世纪生物科技有限公司；离心管和96 孔PCR 反应板，购自美国Axygen 公司；50 ×TAE、溴化乙锭（EB），购自索莱宝生物科技有限公司；琼脂糖，购自西班牙BIO⁃WEST 公司。

1．1．3 仪器设备 PCR 扩增仪，购自美国Applied Biosystems 公司；凝胶电泳仪和凝胶电泳成像系统，购自美国Bio－Rad 公司；恒温培养箱，购自上海一恒科技有限公司；浊度仪，购自无锡市光明浊度仪厂；立式自动压力蒸汽灭菌锅，购自日本三洋公司；生物安全柜，购自美国Thermo 公司；离心机，购自德国Sigma 公司；水浴锅，购自金坛市医疗仪器厂；电冰箱，购自青岛海尔股份有限公司；超低温冰箱，购自美国Thermo 公司；纯水仪，购自Milipore 公司。

1．2 方法

1．2．1 细菌培养 将甘油保种冻存的856 株猪源大肠杆菌从冰箱中取出，放置室温至融化。 在生物安全柜里，用一次性无菌接种环蘸取菌液，划线接种于营养琼脂平板上。 恒温培养箱中37 ℃培养18 h。

1．2．2 模板DNA 的制备 参照《分子克隆操作指南》，采用煮沸法提取细菌DNA 模板。 具体操作方法如下：上述培养的细菌4 ℃10000 r／min 离心5 min；弃上清，用200 μL 的TE 缓冲液将沉淀重悬；在100 ℃水浴中煮10 min 之后立即放置到0 ℃冰水混合物中冰浴10 min，然后4 ℃12000 r／min离心5 min，吸取上清液转移至新的无菌EP 管中作为DNA 扩增模板，置－20 ℃保存备用。

1．2．3 耐药基因的检测 按照李孟等［4］建立的同时检测floR、CTX－M、mcr－1 三种耐药基因的多重PCR 检测方法，对1．2．2 制备的DNA 模板进行多重PCR 扩增，扩增产物在浓度为1．5%的琼脂糖凝胶上进行电泳。 用凝胶成像分析系统对结果进行分析。

1．2．4 药敏试验 对856 株猪源大肠杆菌使用药敏检测板检测菌群对氟苯尼考、头孢噻呋、粘杆菌素的临床耐药性，统计耐药情况。

2 结果与分析

2．1 猪源大肠杆菌耐药基因floR、CTX－M、mcr－1的检测结果 856 株猪源大肠杆菌中floR基因检出率为67． 9% （581／856），CTX－M基因检出率为8．4% （72／856），mcr－ 1 基 因检出率为27． 6%（236／856）。 856 株猪源大肠杆菌中有222 株同时检出两种耐药基因，检出率为25．9%，其中153 株同时检出mcr－1 基因和floR基因，检出率17．9%（153／856），69 株同时检出floR基因和CTX－M基因，检出率为8．1%（69／856），没有菌株同时检出CTX－M基因和mcr－1 基因。 30 株猪源大肠杆菌中同时检出三种耐药基因，检出率3．5%。 部分猪源大肠杆菌的PCR 扩增产物电泳图见图1。

图1 部分样品PCR 扩增产物电泳图Fig 1 Electrophoresis of amplified products PCR part of samples

2．2 不同年份猪源大肠杆菌耐药基因floR、CTX－M、mcr－1 的检测结果 以大肠杆菌分离年份统计，2013 －2018 年floR、CTX－M、mcr－1 基因的检出率见图2。 结果显示，floR基因的检出率最低为2014 年的56．1%、最高为2015 年的79．1%，2013 －2018 年平均检出率为69．7%；CTX－M基因的检出率最低为2013 年的2．6%，之后持续增长至2018 年的18%，平均检出率9．6%；mcr－1 基因的检出率在2014 年达到最高44．4%，2018 年检出率下降为零，平均检出率为24．3%。

图2 2013－2018 年floR、CTX－M、mcr－1 耐药基因检出率Fig 2 The detection rates offloR，CTX－M， andmcr－1 resistance genes

2．3 不同地区猪源大肠杆菌耐药基因floR、CTX－M、mcr－1 检测结果 以大肠杆菌来源地统计，郑州、开封、焦作、许昌地区floR、CTX－M、mcr－1 基因检出率结果见图3。

图3 郑州、开封、焦作、许昌floR、CTX⁃M、mcr⁃1 基因检出率Fig 3 Graphic representation of Zhengzhou，Kaifeng，Jiaozuo，XuchangfloR，CTX⁃M，mcr⁃1 gene detection rates

结果表明，在郑州地区floR、CTX－M、mcr－1基因的检出率分别为72．3%、2．1%、10．2%，在开封地区的检出率分别为84．9%、16．5%、46．5%，在焦作地区的检出率分别为48．5%、6．3%、7．2%，在许昌地区检出率分别为82．3%、15．7%、43．8%。四个地区耐药基因检出率由高到低均为floR＞mcr－1 ＞CTX－M。

2．3．1 2013 －2018 年不同地区floR基因检出率

2013 －2018 年，郑州、开封、焦作、许昌地区大肠杆菌floR基因检出率见图4。 结果显示，2013 －2018年，郑州地区floR基因检出率最低为2013 年的42．9%，最高为2017 年的90．0%，平均检出率为72．3%；开封地区floR基因检出率最低为2013 年的60．0%，最高为2018 年的95．0%，平均检出率为84．9%；焦作地区floR基因检出率最低为2014年的33．9%，最高为2016 年的60．0%，平均检出率为48．5%；许昌地区floR基因检出率最低为2014年的69．4%，最高为2015 年的100%，平均检出率为82．2%。 可以看出，焦作地区floR基因历年检出率均未超过60． 0%，明显低于其他三个地区，除2013 年外，其他年份的检出率均为4 个地区最低。

图4 2013－2018 年郑州、开封、焦作、许昌floR基因检出率Fig 4 The detection rate offloRgenes in Zhengzhou，Kaifeng， Jiaozuo， and Xuchang

2．3．2 2013－2018 年不同地区CTX－M基因检出率2013 －2018 年，郑州、开封、焦作、许昌大肠杆菌CTX－M基因检出率见图5。 郑州地区CTX－M基因检出率2015 年和2018 年均为0，最高为2017 年的5．0%，平均检出率为2．1%；开封地区CTX－M基因检出率2014 年为0，最高为2016 年的38．5%，平均检出率为16．5%；焦作地区CTX－M基因检出率2013 年和2015 年为0，最高为2018 年的15．0%，平均检出率为6．3%；许昌地区CTX－M基因检出率最低为2017 年的3．8%，最高为2018 年的45．0%，平均检出率为15．6%。

图5 2013－2018 年郑州、开封、焦作、许昌CTX⁃M基因检出率Fig 5 The detection rate ofCTX⁃Mgene in Zhengzhou，Kaifeng， Jiaozuo， and Xuchang

2．3．3 2013 －2018 年不同地区mcr－1 基因检出率2013 －2018 年，郑州、开封、焦作、许昌大肠杆菌mcr－1 基因检出率见图6。

图6 2013－2018 年郑州、开封、焦作、许昌mcr⁃1 基因检出率Fig 6 The detection rate ofmcr⁃1 gene in Zhengzhou，Kaifeng， Jiaozuo， and Xuchang

结果显示：4 个地区mcr－ 1 基因检出率从2016 年开始呈下降趋势，并在2018 年均降为0；郑州地区检出率最高为2014 年的22．9%，2017 年检出率下降为0，平均检出率为10．2%；开封地区检出率最高为2014 年的88．0%，2018 年检出率下降为0，平均检出率为46．5%；焦作地区检出率最高为2015 年的20．0%，2017 年检出率下降为0，平均检出率为7．2%；许昌地区检出率最高为2014 年的85．7%，2017 年检出率下降为0，平均检出率为43．8%。

2．4 耐药基因与耐药表型相关性分析 对856 株猪源大肠杆菌进行药敏检测，结果显示：683 株大肠杆菌对氟苯尼考耐药，耐药率为79．8%，耐药菌株中有581 株携带floR基因，携带率为85．1%；133株大肠杆菌对头孢噻呋耐药，耐药率为15．5%，耐药菌株中有72 株携带CTX－M基因，携带率为54．1%；266 株大肠杆菌对粘杆菌素耐药，耐药率为31．1%，耐药菌株中有236 株检出mcr－1 基因，携带率为88．7%。

2．4．1floR基因检出率和氟苯尼考耐药率比较

2013 －2018 年，猪源大肠杆菌中floR基因检出率和氟苯尼考耐药率比较见图7。 数据显示，2013 －2018 年，分离菌株氟苯尼考耐药率最高为2015 年的93．8%，最低为2014 年的59．6%，平均耐药率为81．3%，floR基因检出率与其氟苯尼考的耐药率呈正相关。

图7 floR基因检出率和氟苯尼考耐药率比较图Fig 7 Comparison offloRgene detection rate and florfenicol resistance rate

2．4．2CTX－M基因检出率和头孢噻呋耐药率比较2013 －2018 年，猪源大肠杆菌中CTX－M基因检出率和头孢噻呋耐药率比较见图8。 数据显示，2013 －2018年，分离菌株头孢噻呋耐药率最高为2017 年的48．9%，最低为2013 年的3．6%，平均耐药率为19．0%，CTX－M基因检出率与其头孢噻呋的耐药率基本呈正相关。

图8 CTX－M基因检出率和头孢噻呋耐药率比较图Fig 8 Comparison ofCTX－Mgene detection rate and ceftiofur resistance rate

2．4．3mcr－1 基因检出率和粘杆菌素耐药率比较2013 －2018 年，猪源大肠杆菌中mcr－1 基因检出率和粘杆菌素耐药率比较见图9。 数据显示，2013 －2018年，分离菌株粘杆菌素耐药率最高为2015 年的55%，最低为2018 年的0，平均耐药率为27．9%，mcr－1 基因检出率与其粘杆菌素的耐药率呈正相关。

图9 mcr－1 基因检出率与多粘菌素耐药率比较图Fig 9 Comparison of detection rate of mcr－1 gene and polymyxin resistance rate

3 讨论与结论

调查显示，856 株猪源大肠杆菌中floR基因检出率为67． 9%，CTX－M基因检出率为8． 4%，mcr－1基因检出率为27．6%，其中，floR基因检出率最高，并且2013 －2018 年检出率居高不下，李颖颖［5］的研究表明floR基因已经成为传播介导大肠杆菌耐药的主要基因，说明河南省内的猪源大肠杆菌对氟苯尼考耐药性已经达到较严重程度；CTX－M基因的检出率低于李进福［6］的研究结果（25．81%），但2013 － 2018 年检出率逐年增高；2013 －2015 年河南地区mcr－1 基因的检出率呈上升趋势，与李振斌［7］研究结果一致，但从2016 年开始检出率大幅下降，直至2018 年下降为0，这可能与我国在2016 年农业部第2428 号公告中规定停止硫酸黏菌素用于动物促生长政策有关。

不同地区耐药基因的流行趋势也有一定差异，焦作地区floR基因平均检出率明显低于其他地区；相对于整体水平的持续增长，郑州地区CTX－M基因检出率一直稳定在较低水平；开封和许昌地区mcr－1 基因检出率明显高于郑州和焦作，这些差异可能与各地用药习惯不同有关。

通过统计floR、CTX－M、mcr－1 基因在其耐药菌中的携带率，发现floR基因在氟苯尼考耐药菌株中的携带率为85．1%，低于郭树源等［8］2015 年对山东地区耐氟苯尼考菌株floR基因携带率的研究结果（100%）；CTX－M基因在头孢噻呋耐药菌中的携带率为54．1%，与杨守深等［9］2018 年在福建地区分离的头孢噻呋耐药菌株中CTX－M基因携带率50．1%的结果相近；mcr－1 基因在粘杆菌素耐药菌中携带率较高（88．7%），导致mcr－1 流行的主要原因在于质粒介导的传播方式［10］。

本研究调查了河南省4 个地区floR、CTX－M、mcr－1 三种耐药基因的流行情况，结果表明河南地区氟苯尼考耐药基因floR呈现大流行状况；头孢噻呋耐药基因CTX－M流行情况比较轻微，但呈增长趋势；粘杆菌素耐药基因mcr－1 在政策监管下检出率已经降为0；并且不同地区耐药基因的流行趋势有一定差异。