一种高产琥珀酸耐盐酵母菌的筛选及应用研究

◎ 滑欢欢，梁 亮，扈圆舒，潘丽娟，黄敏斯，尹何南，吴嘉怡

（广东美味鲜调味食品有限公司，广东 中山 528400）

酱油是以大豆和小麦为主要原料，经多种微生物共同作用而形成的具有特殊色、香、味、体的调味品。风味是酱油的一个关键指标，为了满足消费需要和行业竞争力，提高酱油风味是当下亟待解决的问题。

在酱油发酵过程中，因微生物作用产生的醇、醛、酸、酯类物质，是酱油风味形成的主要物质或前体，一般分为挥发性物质和非挥发性物质2 大类。其中，有机酸占非挥发性物质中的主要部分，而用于酱油酿造中的酵母菌是产有机酸的主要微生物。

与酱油风味直接相关的耐盐酵母菌主要有鲁氏接合酵母菌、异变球拟酵母菌等，是酱油发酵过程中经常被利用的微生物。其主要进行酒精发酵，也会参与酱油发酵过程中风味物质酯类、呋喃类、酮类以及琥珀酸的生成，是酱油发酵过程中的主发酵酵母菌。有研究表明，高盐稀态发酵酱油样品中的挥发物，发酵主要挥发物质是酸类和醇类，分别占总含量的47%和14%。由此可见，高盐稀态发酵酱油样品中酸类物质的含量与其风味息息相关[1]。

酱油中的有机酸以乳酸、乙酸为主，酱油的香气主要来自有机酸含量的高低，而且有机酸可以调节高盐稀态工艺发酵酱油中高盐分带来的不适口感，在所有风味物质中，构成酱油风味的骨架体系为醇类、酯类和酚类，其中，酯类物质所占比重最大，而有机酸是酯类的前体物质。

酱油的有机酸中，风味好的酱油一般乳酸含量较高；草酸会给酱油带来涩感；甲酸和乙酸有刺激性气味，会给酱油带来不好的味道，在酱油中含量不宜太高；琥珀酸或其盐类，具有贝类特殊滋味，是唯一一种可以提高酱油鲜味的有机酸。琥铂酸钠热稳定性好，溶解性也较好，可以提高酱油风味[2]。其可以单独使用，也可以和谷氨酸钠一起使用，能起酱油增鲜的作用。目前，在酱油发酵过程中，能产生琥珀酸的微生物只是酵母菌，同时，酵母菌也会产生对酱油风味不好的有机酸，如草酸、甲酸和乙酸。

因此，本文经过诱变选育得到一株能够高产琥珀酸，且不产乙酸和甲酸的耐盐酵母菌M03，在酱油发酵阶段添加此酵母菌，能够显著提高酱油中琥珀酸的含量，从而提高酱油的鲜味和风味品质[3]。

1 试验材料和方法

1.1 试验主要材料

黄豆、小麦、食盐、麦芽汁培养基、碳酸钙、琼脂粉、葡萄糖等，购于市场；沪酿3.042 米曲霉菌种（广东美味鲜调味食品有限公司）。

1.2 主要设备

ARTP 诱变系统、超净工作台、培养箱、耐盐菌扩培系统、种曲机、发酵罐等。

1.3 试验方法

1.3.1 分离培养基及分离方法

选出风味柔和、无刺激酸味且氨基酸态氮含量达到1.1 g/100 mL 的发酵罐，送检总酸、琥珀酸等指标，确定目标酱醪。

耐盐酵母菌的分离：麦芽汁培养基（1 L）、食盐100 g、琼脂粉20 g、0.3%碳酸钙，采用平板涂布法进行分离。

1.3.2 出发菌株的分离与筛选

选用一罐发酵90 d 的生酱油，鲜味十足，风味柔和，无刺激酸味，且氨基酸态氮含量达到1.1 g/100 mL；采用添加0.3%碳酸钙的高盐麦芽汁培养基进行涂布分离，挑取透明圈比较小的10 株酵母菌，命名为SY01、SY02、SY03、SY04、SY05、SY06、SY07、SY08、SY09、SY10；取成熟大曲2 kg，分成10 份，分别与600 g、浓度为20 波美的盐水混合，制成酱醪，将初筛得到的10 株酵母菌，按照6‰比例添加至酱醪初期（制醪时添加），30 ℃恒温发酵120 d，过滤得到生酱油。送检生酱油琥珀酸、乙酸和甲酸、氨基酸态氮等理化指标，挑选表现最好的菌株作为基础菌株进行诱变选育[4]。

1.3.3 出发菌株的诱变及筛选

以酱醪中分离得到的高产琥珀酸的酵母菌为基础菌株，采用ARTP 技术对初发菌株进行诱变，并以致死率等为指标，诱变时间为变量确定诱变参数，获得突变菌株；使用添加0.3%碳酸钙的高盐麦芽汁平板培养基进行筛选。在添加0.3%碳酸钙的高盐麦芽汁平板培养基中，挑取与初发菌株M02 相比具有透明圈小的菌落，进行初筛得到10 株正突变株，命名为SY11、SY12、SY13、SY14、SY15、SY16、SY17、SY18、SY19、SY20，再进行酱醪发酵复筛。

初筛方法：将含有酵母菌的样品采用添加3‰的高盐（10%）麦芽汁培养基平板进行涂布分离，观察平板上单菌落的透明圈大小，透明圈越小，说明产总酸越低。复筛方法：挑取透明圈小的单菌落，于液体高盐（10%）麦芽汁培养基中，得到培养菌液；将培养菌液按照6‰的比例添加至初期酱醪中，进行30 ℃恒温发酵120 d，得到原油，按照常规方法检测生酱油中琥珀酸、乙酸和甲酸、氨基酸态氮等理化指标。

1.3.4 诱变菌株M03 遗传稳定性的研究

将诱变获得的酵母菌在液体高盐（10%）麦芽汁培养基进行连续传代10 次，将第1 代、第5 代和第10 代菌株的培养液，添加至初期酱醪中，30 ℃恒温发酵90 d，过滤得到原油，检测原油中琥珀酸、乙酸和甲酸、氨基酸态氮等理化指标在各代之间稳定[5]。

1.3.5 诱变得到的酵母菌M03 在酿造酱油中的应用

诱变获得的目标酵母菌按照生产工艺进行扩大培养，得到培养液，按照6‰的比例添加至初期酱醪中，发酵180 d，得到原油，对比发酵原油中琥珀酸、甲酸、乙酸、总酸等含量，并感官鉴评原油风味[6]。

2 试验结果分析

2.1 出发菌株的分离与筛选

由表1 结果可知，经分离得到的酵母菌菌株，添加至酱醪初期，得到的原油添加酵母菌SY7 后，原油中琥珀酸含量最高，挥发性酸甲酸和乙酸明显降低，总酸也大大降低。从理化指标可以看出，菌株SY7 效果最优，命名为酵母菌M02，并将此菌株作为出发菌株，进行ARTP 诱变选育。

表1 添加不同酵母菌菌株发酵原油的理化结果分析表（检测结果单位：g/100 mL）

2.2 出发菌株的诱变及筛选

由图1、表2 可知，本文以基础菌种M02 为出发菌株进行ARTP 诱变，初筛得到10 株突变菌株，添加至酱醪初期经发酵得到的原油，添加突变菌株SY16后，原油中琥珀酸含量与出发菌株相比提高45%，未检出甲酸和乙酸，总酸也大大降低，与出发菌株相比下降11.7%。从理化指标可以看出，菌株SY16 效果最优，命名为M03[7-8]。

图1 诱变后涂布分离平板正反面透明圈的大小图

表2 添加不同突变菌株发酵原油的理化结果分析表（检测结果单位：g/100 mL）

2.3 诱变菌株M03 遗传稳定性的研究

如表3 所示，从发酵原油的理化及培养液的理化结果来看，酵母菌M03 遗传稳定性良好。

表3 酵母菌株传代稳定性检测结果表（检测结果单位：g/100 mL）

2.4 诱变得到的酵母菌M03 在酿造酱油中的应用

由表4 结果显示，采用酵母菌株M03 发酵得到的原油，氨基酸态氮含量略高于出发菌株，琥珀酸含量远远高于出发菌株，乙酸和甲酸产率特别低。由此可见，将酵母菌株M03 应用于酱油酿造，可明显改善酱油的风味，提高酱油品质，降低酱油酿造成本。

表4 出发菌株M02 和诱变菌株M03 发酵原油的理化结果对比表（检测结果单位：g/100 mL）

此外，本文还召集20 名有丰富经验的鉴评人员进行感官鉴评，感官鉴评的评价指标包括鲜味、酸味、香气、刺激性，分值为0～5 分，评价分数越高，该项指标越好。综合评价指的是样品的综合感官、整体给评价员的感官，鉴评结果见表5。

表5 添加酵母菌发酵原油感官鉴评打分结果表

由表5 感官结果可知，酸味和刺激性是相反的，分值越高，原油风味越差，酸味突出，有一股刺激性的味道弥散开来。结果显示，添加诱变酵母菌M03 后，发酵原油的观感鉴评综合结果最优。

综上所述，添加酵母菌M03 发酵酱油，可以显著改善酱油口感和风味，全面提升酱油质量，应用前景广阔。

3 结论

本文经过诱变选育得到一株高产琥珀酸的耐盐酵母菌M03，且该酵母菌不产乙酸和甲酸等挥发性有机酸；采用酵母菌株M03 发酵得到的原油，氨基酸态氮含量略高于出发菌株，琥珀酸含量远远高于出发菌株，乙酸和甲酸产率特别低。可见，将酵母菌株M03 应用于酱油酿造，可明显改善酱油的风味，提高酱油品质，降低酱油酿造成本。