昆虫杆状病毒及其应用研究进展

梁振普,陈阳光,杜俊阳,曹瀚文,张小霞,代金平,杨新平,苏萍

(1.河南农业大学生命科学学院,河南 郑州 450002;2.新疆农业科学院微生物应用研究所,新疆 乌鲁木齐 830091;3.新疆生产建设兵团第十四师农业科学研究所, 新疆 昆玉 848116)

众所周知,害虫对农作物的破坏会造成巨大的经济损失[1]。在害虫的应急防控中,化学杀虫剂的使用仍然是传统的技术手段。由于化学杀虫剂的广泛使用,不仅造成了环境污染,同时随着同类杀虫剂的反复使用,不可避免地造成了目标害虫抗药性增加等诸多生态学问题[2-3]。相对于化学防治,生物防治是一种对环境友好的防治策略。生物杀虫剂(如杆状病毒杀虫剂)因其具有特异性高、易于生物降解、对哺乳动物和环境都安全等诸多优点,在现代农业绿色防控中也逐渐受到重视[4-5]。但是野生型杆状病毒杀虫剂具杀虫谱窄、杀虫速度较慢等缺陷,这在很大程度上妨碍了其推广应用。针对野生型杆状病毒在应用中的不足之处,人们通过基因工程技术对其进行分子改良,有望改进这些缺点,从而增加这类杀虫剂的市场竞争力。

本文综述了杆状病毒和其作为杀虫剂方面的应用、杆状病毒杀虫剂的生产工艺及在遗传改良方面取得的进展,同时对昆虫杆状病毒杀虫剂的应用前景进行了展望。

1 杆状病毒的概述

杆状病毒属于杆状病毒科(Baculoviridae),其特点是有包涵体(occlusion body,OB),鉴于其OB的形态特征可分为两个属,即核型多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus,NPV)和颗粒体病毒属(Ganulovirus,GV),其中NPV的包涵体呈现不规则多角体形状,GV的包涵体呈圆形或卵圆形[6]。杆状病毒是一类对节肢动物具有感染性的病毒,具有很高的宿主特异性。杆状病毒在其生命周期中会产生两种形式的病毒粒子,即包埋型病毒粒子(occlusion-derived virion,ODV)和芽生型病毒粒子(budded virion,BV)[6]。这两种病毒粒子的核衣壳结构相同,但囊膜来源不同,BV的囊膜来源于细胞膜,而ODV的囊膜来源于核膜,这导致了两种病毒粒子在侵染过程中发挥不同的作用。其中,BV负责在细胞间进行传播,而ODV在经口感染宿主的过程中发挥着重要作用[7]。包涵体是ODV被多角体蛋白包裹形成的稳定结构,可以帮助杆状病毒抵抗外界环境的降解,在杆状病毒的应用方面具有不可替代的作用。

2 昆虫杆状病毒载体表达系统及其应用

昆虫杆状病毒表达系统 (baculovirus expression vector system,BEVS) 是一种在昆虫细胞内进行蛋白表达的表达系统,现已广泛应用于外源蛋白表达、病毒样颗粒表制备、杆状病毒表面展示系统等领域。在当今基因工程领域四大表达系统中,由于BEVS可以同时表达多个蛋白并且可以对蛋白进行翻译后修饰,使其成为应用广泛的真核表达系统[8]。

利用杆状病毒表达外源蛋白,需要制备具有感染性的重组病毒,而最初构建重组杆状病毒是用同源重组的方法,此方法制备重组杆状病毒需要经过多轮空斑筛选,其过程费时费力,同时,也极易得到假阳性重组病毒。为了解决以上问题,LUCKOW等[9]将细菌的mini-F复制子整合到杆状病毒基因组,构建一种既能在大肠杆菌中复制,也能感染昆虫细胞的新型杆状病毒穿梭载体(bacmid)。图1是重组杆状病毒构建示意图。具体过程如下:首先,将目标基因插入到供体(donor)质粒,获得重组donor质粒。然后,将重组donor质粒转化到大肠杆菌DH10Bac细胞,在辅助(helper)质粒编码的转座酶帮助下,将位于重组donor质粒Tn7R-Tn7L间的外源基因特异性地转座到bacmid上,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定可获得重组bacmid。

图1 重组杆状病毒构建示意图Figure 1 Schematic diagram of recombinant baculovirus construction

2.1 外源蛋白表达

通过对杆状病毒表达系统的不断优化,使得外源基因插入到杆状病毒表达载体中的成功率有所提高,所以有越来越多的外源基因可以通过该系统进行表达。该系统进行外源蛋白表达有以下优点:1)可以对外源蛋白进行翻译后修饰;2)BEVS具有强启动子,如强多角体蛋白启动子或P10强启动子,可以高水平表达外源蛋白;3)可以同时表达多个外源蛋白。该系统表达的外源蛋白有以下应用:1)BEVS产生的蛋白质可用药物筛选、外源蛋白结构和功能分析、生产蛋白质治疗药物[10-11];2)表达多种蛋白质,包括糖蛋白、酶、重组病毒、酶和疫苗。

2.2 昆虫杆状病毒表达病毒样颗粒

病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)是由一个或多个内源结构蛋白组装形成的结构化蛋白颗粒,缺乏病毒遗传物质,因此不具有传染性[12];根据亲本病毒的结构,VLP存在有无包膜之分。构建的VLP在形态结构上与天然的病毒颗粒相似,因此可以高效地诱发体液与细胞免疫,具有很强的生物学活性,这被认为是一种安全的候选疫苗[13-14],是一种可以展示真实构象的病毒抗原。

目前,VLP的生产常利用昆虫杆状病毒表达系统[15]。人乳头瘤病毒、流感病毒[16]、丙型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒等病毒都在昆虫杆状病毒系统中成功表达出了病毒样颗粒[17]。VLP还可借助先进的材料进一步得到广泛应用。目前,VLP被用作纳米机器[18],将药物活性产品输送到人体内的特定细胞的特定部位。在全球流行的COVID-19方面,VLP生产的COVID-19疫苗同样具有优势,可以通过BEVS合成新冠病毒蛋白,形成VLP[11]。

2.3 杆状病毒表面展示系统及其应用

杆状病毒展示技术(baculovirus surface display,BSD)是一种在杆状病毒表面展示外源性多肽和蛋白质的新方法。它是创建和展示表位特异性抗体结合位或任何其他感兴趣的肽或蛋白质的有效方法,可用于抗体、疫苗和生物药物的研发[19-20]。在杆状病毒上展示感兴趣的蛋白质,通常是在衣壳或病毒囊膜上进行展示[21]。一种展示策略是在AcMNPV上进行了外源蛋白的插入,在主要的囊膜蛋白GP64上进行了融合或者将外源蛋白融合到GP64的氨基末端[22-23]。另一种展示策略是与杆状病毒的衣壳蛋白融合,例如AcMNPV最丰富的核衣壳蛋白VP39。在VP39的氨基或羧基末端融合导致成功展示感兴趣的蛋白质[19]。

3 昆虫杆状病毒在杀虫剂中的研究及应用

3.1 昆虫杆状病毒杀虫剂的优缺点

昆虫病原病毒是微生物源杀虫剂的重要种类,大多数研究集中在杆状病毒上。杆状病毒作为杀虫剂有以下几个优点:1)在众多昆虫病毒中,杆状病毒被认为是安全且有选择性的生物杀虫剂,仅限于无脊椎动物,它们在世界范围内被广泛用于防治以鳞翅目为主的多种害虫[24],也对非目标生物无害,包括有益的捕食者、脊椎动物和植物[25-26];2)杆状病毒可在昆虫种群中引起流行,并在环境中长期有效[27];3)昆虫对许多化学农药产生抗性,但杆状病毒杀虫剂对昆虫的使用很少产生抗性[24];4)杆状病毒可以与其他害虫防治方法一起使用,提高杀虫效率。

缺点:1)由于杆状病毒具有较高的特异性,使其宿主范围变窄,限制了应用范围[28];2)杀死目标害虫的速度相对较慢,某些杆状病毒,如核型多角体病毒,通常需要3～7 d时间才能杀死宿主[29];3)昆虫病毒不易长期储存,生产成本相对于传统化学农药高[29-30]。

3.2 昆虫杆状病毒杀虫剂的应用

3.2.1 独立使用 杆状病毒杀虫剂在许多国家被用于鳞翅目、膜翅目和鞘翅目的防治,其中在控制鳞翅目害虫中应用最为广泛[31-32]。目前,世界各地已经开发了使用昆虫杆状病毒杀虫剂的项目,许多杆状病毒杀虫剂已经在阿根廷、澳大利亚、加拿大、哥伦比亚、德国、印度、日本、秘鲁、南非和美国等国家注册[29,33-36]。中国昆虫病毒的研究始于20世纪50年代中期家蚕核型多角体病毒,而将昆虫病毒作为生物防治剂的使用始于20世纪60年代初[37]。迄今为止,中国已使用超过32种昆虫病毒来控制农业、林业、牧场和花园中的害虫。截至2023年,12种病毒被中华人民共和国农业农村部批准为商品病毒杀虫剂,其中10种属于杆状病毒科(http://www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml)。

3.2.2 复配使用 由于杆状病毒单独用于防治害虫会导致以下两个问题:一是杀虫速度缓慢,导致农作物受损严重;二是病毒的宿主特异性强,导致只作用一种害虫。在应用上,经常把杆状病毒与其他成分进行复配使用,根据复合剂复合成分的不同,可把昆虫病毒复合杀虫剂概括为两大类型:一种类型是低毒化学农药与病毒复配的杀虫剂,该杀虫剂可显著提高杀虫效率,同时也减少了化学农药的用量;第二种类型是微生物与病毒复合的杀虫剂,该杀虫剂具有广谱性、速效性和特异性[38]。昆虫病毒与微生物复合生物杀虫剂既具有良好从杀虫效果,又能克服重组病毒生产上的困难,易于实现产业化。例如,20世纪80年代美国亚利桑那大学西棉研究室采用AcNPV与Bt复配剂防治棉花烟芽夜蛾,近年来我国采用小菜蛾颗粒体病毒-Bt复合生物杀虫剂防治小菜蛾都取得了令人十分满意的防治效果[39]。

3.3 昆虫杆状病毒的遗传改造

实践表明,与化学杀虫剂相比,杆状病毒杀虫剂具有高度专一性、不杀伤天敌、对哺乳动物和环境安全等优点[6]。但是,野生型昆虫杆状病毒具有杀虫速度慢、稳定性差和宿主域窄等缺点,因此学者们开始利用基因工程和分子生物学等手段来改造昆虫病毒基因组,以创制高效、稳定、防治面较广的昆虫杆状病毒杀虫剂[40-41]。

3.3.1 将外源基因插入杆状病毒基因组 可以利用基因工程技术,将外源基因插入到杆状病毒基因组中构建重组病毒,以提高杀虫效率[42]。这些外源基因大致有2种类型:一类是昆虫激素,它们参与调节宿主昆虫发育、行为和生理状态。在杆状病毒感染期间,它们的过度表达会改变昆虫宿主的发育、行为或稳态,进而导致幼虫宿主更快地死于病毒感染或更快地停止进食[43]。目前普遍常用的昆虫激素有利尿激素、羽化激素、促前胸腺激素和保幼激素酯酶[44-47]。另一类外源基因是来自各种有毒动物的神经毒素,包括草螨毒素tox34.4,蝎神经毒素AaIT和LqhIT2,蜘蛛毒素μ-Aga-Ⅳ、Cit1a和Ar1b,以及海葵毒素As Ⅱ和Sh Ⅰ,这些毒素可作用于害虫引起害虫麻痹,停止进食进而加速死亡[2]。重组杆状病毒杀虫效率因启动子、外源基因、宿主昆虫、病毒剂量和侵染方法的不同而产生不同的杀虫效果[48]。

3.3.2 缺失杆状病毒的非必需基因的杀虫剂 由于杆状病毒基因组中存在一些对病毒自身复制、增殖非必需的基因。因此,可缺失和修饰非必需基因,进而提高杆状病毒的杀虫效率[49]。目前,人们已经构建出缺失egt、p10和p74基因的重组杆状病毒[47,50-51]。最成功的例子是egt的缺失能够显著增强杆状病毒的致病性,进而提高杀虫效率。egt编码蜕皮甾体脲苷二磷酸葡糖转移酶(ecdysteroid UDP-glucosyltransferase,EGT),是杆状病毒非必需的早期基因, 同时也是昆虫病毒中迄今为止已知的唯一在个体水平调控感染宿主的基因[52]。EGT酶通过催化糖分子与蜕皮甾体激素结合,阻止蜕皮甾体进入细胞并有效地灭活蜕皮甾体激素,从而阻止幼虫蜕皮,进而导致幼虫继续取食、体重增加、病毒产量提高[47,52-53]。研究发现egt的缺失往往会加速宿主幼虫的死亡,因此可以通过对egt的缺失来提高杀虫效率[54]。

3.3.3 拓宽杀虫谱的杀虫剂 由于杆状病毒通常具有较窄的杀虫谱,了解它们控制宿主范围的机制是改进其作为杀虫剂应用的先决条件[28]。先前的研究报道了一些与宿主范围相关的基因如p143、hrf-1、hcf-1、ie2、p35和iap,通过对这些基因的修饰或者缺失能够使宿主的范围变广[55]。最近研究发现将缺乏p35的AcMNPV突变体(vAc Δp35)和SeMNPV的DNA片段共转染Sf9细胞,得到宿主范围扩大的重组病毒株(vAcRev)。在四种昆虫细胞系和三种昆虫幼虫中验证了 vAcRev的宿主特异,发现其不仅能够感染该病毒的亲本宿主,而且能够感染其他昆虫宿主[34]。

3.3.4 影响昆虫激素相关基因的表达 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是通过内源或外源双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引发mRNA降解,导致特异性基因沉默,在生物学研究中广泛应用并显示出巨大的潜力[56-57]。在防治农业害虫和病原体方面,RNAi技术已成为研究基因功能的有力遗传工具[58]。先前的研究发现,JH酸性甲基转移酶(JHAMT)是一种不可替代的酶,在保幼激素(JH)合成中尤为重要。JH结合蛋白基因(JHBP)可以保护化学不稳定的JH免受非特异性酶降解,抑制两个基因HaJHAMT和HaJHBP的表达,以降低棉铃虫的JH浓度并进一步影响幼虫的存活[43,59-60]。基于此,LIU等[43]构建了针对棉铃虫JHAMT和JHBP dsRNA的重组HearNPV,通过抑制这两个基因的表达进而提高杆状病毒的杀虫活性。

MicroRNAs(miRNAs)是一类小的非编码RNA,能够在转录后水平调控mRNA的表达具有重要的生物学功能[61-62]。在昆虫中,miRNAs已经被证明可以调节整个生命周期的各种生理过程,包括蜕皮、变态、卵发生、胚胎发生、行为和免疫[62-63]。miRNA在杆状病毒感染和病毒宿主相互作用中也起着重要作用[64]。研究发现bantam是Sf9细胞中最丰富的miRNA之一。用bantam的抑制剂饲喂斜纹夜蛾和甜菜夜蛾的幼虫,可以导致昆虫幼虫生长异常、化蛹率降低、增加AcMNPV对昆虫的传染性、导致幼虫加速死亡[65-66]。当抑制bantam的水平时,可以提高受感染昆虫的蜕皮激素(20-羟基蜕皮激素)的水平,导致对杆状病毒感染的易感性增加,使病毒具有更强的杀虫活性和更短的致死时间[64]。

4 杆状病毒杀虫剂的生产

杆状病毒和其他病毒一样,只能在活细胞、活组织或有机体中生长繁殖。用细胞培养来大规模生产昆虫病毒,由于生产成本和生产过程中的技术问题,还没有大规模应用。目前为止,大多数商业化的杆状病毒的生产,还需要在宿主昆虫中进行。杆状病毒杀虫剂生产工艺一般分为工厂化生产和野外田间生产。

以棉铃虫杆状病毒杀虫剂为例,工厂化生产杆状病毒杀虫剂的步骤包括选留虫种、成虫交配产卵、幼虫饲养、病毒感染增殖、病死虫收集、制剂加工、产品检测和分装等。选择健康的棉铃虫,在产卵箱内进行交配产卵,虫卵落在产卵箱的纸帕上。将带有虫卵的纸帕进行消毒,然后转移到有人工饲料的养虫盘上,最后放在饲养室。当幼虫发育到4龄,5%用来留种,95%用来生产病毒。感染后第6天开始收集病死幼虫。将收集的病毒致死幼虫,经研磨,离心除杂,喷雾或者冷冻干燥,再加辅助剂混合,经0.25 mm过筛,即成可湿性粉剂,检验合格后称量分装[67]。

以茶蚕颗粒体病毒杀虫剂为例,野外田间生产杆状病毒杀虫剂的步骤如下:选择存在大量茶蚕的茶园、于茶蚕2～3龄期喷洒病毒、接毒后7～15 d即为感病死亡高峰期、病死虫收集、制剂加工、产品检测和分装[68]。后面步骤基本同工厂化生产病毒杀虫剂一致。

5 昆虫杆状病毒杀虫剂的安全性

杆状病毒作为生物农药具有若干优势。它们是自然产生的病原体,对昆虫和密切相关的节肢动物具有高度特异性。就对脊椎动物(如哺乳动物、鸟类、鱼类、两栖动物、爬行动物)的致病性而言,它们是安全的。此外,它们对自然抑制害虫种群的有益生物的致病性是友好的[4-5]。虽然杆状病毒在昆虫种群的自然控制中起着重要作用,但从农业工业的角度来看,天然杆状病毒是不完美的杀虫剂。许多作物只能承受最低程度的果实或叶面损害。天然杆状病毒的自然杀伤速度为3～7 d以上。利用重组DNA技术修饰杆状病毒,解决了杀伤速度慢的问题,然而其安全性需要重新评估[69]。在研究重组病毒是否影响动物的试验中,肖化忠等[70]将重组病毒口服或水中投毒感染健康的动物,并将感染后的动物解剖,组织切片及电镜观察。结果表明:被重组病毒感染的动物活动正常脏器无病变且电镜观察并没有病毒粒子存在。在研究重组病毒是否影响培养细胞的试验中,肖化忠等[70]将不同种类的细胞培养成单层,并使用不同梯度的BV去感染,最后不同时间点进行观察,被重组病毒感染的细胞与对照组无明显差别。尽管以上结果说明,重组病毒对动物是安全的对人和动物细胞不造成感染,但是重组病毒也不是绝对安全的,对其生物安全性还要进行长期、深入全面地分析和研究。

6 昆虫杆状病毒研究与应用展望

随着对杆状病毒的研究越来越深入,对杆状病毒的应用也将越来越普遍。各种各样的病毒和疾病等危害人类和其他哺乳动物的生存,杆状病毒表达系统在疫苗研究、基因治疗、药物筛选、蛋白表达方面和生物杀虫剂方面越来越重要。近3年来,在全球范围爆发的新冠肺炎病毒,杆状病毒表达系统被用来表达新冠病毒蛋白形成VLP,这进一步揭示了在未来医疗方面,杆状病毒表达系统将被应用更加广泛。在未来的基因治疗领域,杆状病毒可能针对某些癌症、遗传病、基因缺陷等疾病有不可低估的应用前景。针对农业害虫防治,重组昆虫杆状病毒杀虫剂的研究可从以下几个方面考虑:一是寻找一些新的外源基因,充分利用基因工程技术对杆状病毒进行改造,提高杀虫效率;二是解决重组昆虫杆状病毒杀虫剂在生产中遇到的问题,降低生产成本;三是解决重组昆虫杆状病毒杀虫剂在运输和保存中遇到的问题,保证高质量重组昆虫杆状病毒杀虫剂的供应;四是探索杆状病毒在大田环境中应用的稳定性,从而为以后昆虫杆状病毒杀虫剂的进一步开发和应用打下基础。