番鸭细小病毒病研究进展

赵宗伟，马启禄，王鹤童，李翠萍

1.濮阳县子岸镇农业服务中心，河南濮阳 457100；2.安阳市殷都区畜牧服务中心，河南安阳 455000；3.平舆县农业综合行政执法大队，河南平舆 463400；4.商丘市动物检疫和疫病预防控制中心，河南商丘 476000）

水禽细小病毒病是一种急性、高传染性疾病，可引起雏鹅和番鸭较高的发病率和病死率，给水禽养殖业造成了巨大经济损失。根据遗传特征、中和试验结果和宿主范围可将水禽细小病毒分为鹅细小病毒（goose parvovirus，GPV）相关类群和番鸭细小病毒（muscovy duck parvovirus，MDPV）相关类群[1-2]。近年来，一种新型鹅细小病毒（novel goose parvovirus，NGPV）被报道，已有的研究证明该病毒为GPV的衍生株[3]。MDPV仅感染番鸭，可导致3周龄以下番鸭出现心包积液、肝脏病变、胰腺坏死等组织病理学变化[4-5]，临床表现为发育迟缓，足虚弱、气喘、腹泻和死亡[6-7]。MDPV在器官中可以多阶段复制[7-10]。尽管疫苗接种能够降低MDPV感染风险，但这种急性传染病仍然对水禽产业的发展构成了严重威胁。本文从MDPV感染的病原学、流行病学、诊断技术和综合防控等方面进行了阐述，以期为从业者学习和了解该病毒提供较为系统的内容，也为番鸭细小病毒病防控提供参考资料。

1 病原学

MDPV属于细小病毒亚科依赖病毒属，是一种无囊膜、单链DNA病毒，病毒粒子为球形，呈正二十面体对称结构，直径为20～25 nm。MDPV基因组全长约5.1 kb，包括2个开放阅读框（open reading frame，ORF）。左侧ORF编码的2个非结构蛋白（NS1和NS2）主要参与病毒复制和调节，又称为调节蛋白（regulatory protein，REP）；右侧ORF编码的3个衣壳蛋白（VP1、VP2和VP3）是细小病毒嗜性、致病性和宿主范围的重要决定因素[11]。VP1、VP2和VP3在3'端具有相同的基因序列和终止密码子，但其起始密码子位于序列的不同位置。VP3是MDPV主要的衣壳蛋白和保护性抗原，其含有的抗原表位能够诱导机体产生中和抗体，并对其他水禽细小病毒提供保护性的交叉免疫。此外，在MDPV基因组的两端还存在着约456 bp的倒置末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR）、1个末端解析位点（terminal resolution site，TRS）、Rep蛋白结合位点（rep binding elements，RBSs）和其他转录因子结合位点等，均与基因复制和转录等密切相关。ITR外部可以自行折叠形成回文发卡结构，而其内部则与3'ITR的序列反向互补，使整个病毒基因组形成更大范围的回文结构[12-13]。

重组和变异在细小病毒快速进化中起着重要作用。研究者在我国多个省份的鸭群中分离到一种新的重组MDPV（rMDPV），该病毒感染的小鸭肠道发生栓塞，死亡率高。分析结果显示，该病毒由经典MDPV与经典GPVs交换了部分VP3基因序列后重组而来[14-15]。与GPV相比，rMDPV ITRs与经典MDPV具有更高的同源性，其Rep蛋白也与经典MDPV同源性很高。rMDPV ITRs和Rep蛋白之间的相互作用不受重组影响[16]。

2 流行病学

番鸭细小病毒病最早由我国发现，随后法国和日本等国家也陆续报道该病[6，17-19]。我国台湾地区发生了2起水禽细小病毒感染事件[20]。第1次疫情与GPV相关，影响了鹅和番鸭；第2次疫情与MDPV相关，该次疫情中许多品种的鸭受影响，但鹅幸免于难。1997—1998年，美国加利福尼亚州商品番鸭出现身体虚弱，无法行走且死亡率高的情况，剖检发现患病鸭腿部肌肉和心肌苍白，肝脏有纤维蛋白渗出物，经鉴定证实病原为MDPV[6]。2011年我国在广西商品番鸭中检测到MDPV，患病鸭主要临床表现为水样腹泻和运动功能障碍[21]。MDPV只感染番鸭，在鸡、鹅、麻鸭、半番鸭和樱桃谷鸭等中暂无临床发病的报道，且人工感染不发病[15，22]。MDPV对鹅没有致病性，而GPV不仅对雏鹅具有致病性，而且对番小鸭也具有致病性[7，19]。番鸭细小病毒病的流行无明显季节性，但由于冬春季节气温较低，育雏室因控温导致空气流通不够，空气质量较差，从而导致该病的发病率和病死率相对更高。MDPV主要通过呼吸道和消化道传播，如可通过患病鸭的排泄物再经饲料、饮水及饲养设施进行传播[23]，还可污染种蛋及孵化室，造成雏鸭批量发病。

MDPV感染的潜伏期通常为4～9 d，病程为2～7 d。根据感染雏鸭的日龄不同，MDPV感染的死亡率也存在一定差异，死亡率最高可达80%。虽然3周龄后鸭子感染的死亡率要低得多，但感染治愈后会出现骨骼肌退化和生长迟缓的症状，且生产性能降低，不再具备经济价值。发病鸭通常表现为运动功能障碍、生长发育迟缓、水样腹泻和死亡。剖检可见患病鸭心脏呈圆形，心脏壁松弛，肝脏肿胀脆弱，胰腺内有白色坏死斑点，肠黏膜有炎症、出血，肠内容物中有脱落的肠黏膜，部分还可见身体骨骼肌质量减少和腿部骨骼肌苍白[24-25]。

3 诊断技术

3.1 病毒分离培养

病毒分离培养是一种常用的诊断技术，在病毒性疾病防控中起着重要作用。将MDPV感染病料经尿囊腔接种10日龄番鸭胚，培养5 d，盲传5代，可发现试验组番鸭胚死亡且较对照组鸭胚小，绒毛尿囊膜增厚，胚胎充血并出现溶血现象[23]。MDPV还可以在番鸭胚肾（MDEK）和番鸭胚成纤维细胞（MDEF）中增殖。Poonia等[26]将病料组织匀浆液接种番鸭胚后的尿囊液在MDEF中连续传代6次后，发现细胞出现病变，随后利用透射电子显微镜和PCR方法证明MDPV被成功分离。黄瑜[27]将番鸭胚传代的MDPV接种到原代鸭胚成纤维细胞（DEF）中，发现细胞状态变差，出现明显的细胞病变（变细、变长），利用免疫荧光试验（IFA）可检测到免疫荧光信号。目前SPF级别的番鸭胚获取难度较大，病毒分离容易受母源抗体干扰。然而MDPV接种细胞后需要适应细胞环境，传代次数较多，因此番鸭胚依然是进行MDPV分离的首要选择。

3.2 血清学诊断

血清学诊断主要是利用抗原、抗体在体内或体外发生的特异性结合反应来实现检测目的的方法。目前，针对MDPV常用的血清学诊断方法有免疫荧光IFA、酶联免疫吸附试验（ELISA）以及琼脂扩散试验（AGP）等。

3.2.1 IFA IFA最早于1942年被首次报道，并在1950年被完善，借助荧光显微镜，可以观察到组织或者细胞的特异性免疫反应，实现对特定抗原的定位和定性分析[28]。IFA特异性强、敏感性高，已被广泛应用于科学研究和临床诊断。Le Gall-Reculé等[29]利用杆状病毒表达系统克隆了MDPV衣壳蛋白VP2和VP3的编码基因，使其在昆虫细胞中表达，并通过IFA技术在昆虫细胞的细胞核中发现了重组蛋白。Yin等[30]借助IFA技术测定并评估了单克隆抗体对GPV和MDPV VP3蛋白天然结构的识别情况，不仅发现单克隆抗体与VP3蛋白发生了结合，还确认该蛋白主要存在于细胞核中，很少在感染细胞的细胞质中。Woolcock等[6]从1～4周龄商品番鸭中分离到MDPV，并利用IFA对其抗体进行了检测。

3.2.2 ELISA ELISA方法是最早由瑞典科学家Engvall和Perlmann[31]以及荷兰科学家Schuurs和Van Weemen[32]构思出来的一种免疫酶技术，它取代了原有的放射免疫检测，降低了放射免疫检测中放射性标记抗原或抗体带来的危害。目前ELISA方法已经在MDPV抗体检测中得到较为广泛的应用。

3.2.3 AGP AGP方法中，可溶性抗原与相应抗体（抗血清）在琼脂凝胶中向四周扩散，如果抗原和抗体相对应，则会在适当比例处形成肉眼可见的白色沉淀线，从而用于抗原或抗体的定性检测[33]。何海蓉等[34]将MDPV M91毒株接种鹅胚，收获鹅胚尿囊液浓缩后制备了AGP抗原，与抗MDPV免疫血清组合建立了AGP方法。该方法可用于MDPV疫苗的免疫检测，但它与GPV存在交叉反应，特异性效果不理想。

3.3 分子生物学诊断

3.3.1 聚合酶链式反应（PCR） PCR是一种功能强大的扩增技术，可以从少量起始材料（即DNA模板或目标序列）中生成充足的特定DNA片段，已成为病毒检测和分型不可缺少的工具。Wan等[35]建立了可以实现MDPV和GPV鉴别诊断的双重PCR方法，最低检测限可达103copies/μL。饶体宇等[36]建立了针对鸭瘟病毒、GPV和MDPV的三重PCR检测方法，可以实现对3种病原的鉴别诊断，最低检测限分别为237.30、22.45和204.60 pg。

3.3.2 实时荧光定量PCR（qPCR） qPCR是在传统PCR的基础上引入荧光探针，在提高检测特异性和灵敏度的同时，实现了检测结果的实时监测，已被广泛用于病毒发病机制研究和流行病学监测。谢丽基等[37]参考GenBank中MDPVREP基因序列，设计了特异性引物及探针，建立了检测MDPV的qPCR方法，扩增时间仅需30 min，敏感性可达20 copies/μL，较常规PCR敏感100倍。在此基础上，谢丽基等[38]又建立了可以同时检测鸭I型肝炎病毒和MDPV的双重qPCR方法。吴双等[39]建立了鸭坦布苏病毒（DTMUV）、鸭肠炎病毒（DEV）和MDPV的TaqMan三重qPCR诊断方法，可以检测到101copies/μL的MDPV阳性标准质粒。林甦等[40]基于SYBR Green I方法，建立了一种可以同时检测GPV和MDPV的qPCR方法，能够实现两种疾病的鉴别诊断。谢守玉等[41]建立了GPV、MDPV和鸭圆环病毒的多重TaqMan qPCR方法，对质粒标准品的检测限可达7.5×101copies/μL。

3.3.3 环介导等温扩增（LAMP）技术 LAMP是一种可以在恒温条件下实现核酸快速扩增的技术。该技术灵敏性、特异性均较好，操作简单，避免了传统PCR方法温度循环的种种不便，已经被广泛应用于病原微生物和传染病诊断等多个领域。Ji等[42]针对MDPVVP3基因的6个特异性靶基因片段设计了引物，建立了LAMP检测方法，可用于MDPV与其他鸭源病原，特别是GPV的鉴别诊断，其灵敏性较PCR方法提高了10倍。该方法对仪器要求较低，适用于没有精确温度控制器以及电泳和凝胶成像设备的现场或小规模实验室。

3.3.4 重组酶介导等温扩增技术（RAA） RAA是近年来新开发的恒温核酸扩增技术。在恒温条件下（37～42 ℃），重组酶、引物和单链结合蛋白形成复合物，当引物搜索到配对的DNA模板时，在DNA聚合酶的作用下合成新DNA链，仅需30 min即可完成对目的片段的快速扩增[43]。黄俊霖[44]针对MDPVVP1基因保守区域序列设计特异性引物，建立了基础型RAA检测方法，该方法特异性较好，灵敏度与PCR一致，耗时短、操作简便，但较易造成气溶胶污染，可能出现假阳性结果。

3.3.5 斑点杂交 斑点杂交是将待测DNA变性后点加在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，经标记的探针杂交后，通过显影斑点的有无以及深浅判断结果的检测方法。该方法操作简单，结果无需电泳或者转印，可以直接在膜上显示结果，是目前常用的分子生物学诊断技术。Le等[3]将使用与碱性磷酸酶缀合的抗地高辛抗体Fab片段，通过免疫酶反应检测杂交的MDPV DNA探针，并通过化学发光反应观察结果。该方法特异性及灵敏性均较好，最低检测限可达3 fg。

4 疫苗

目前针对MDPV感染主要以疫苗预防为主，MDPV疫苗主要分为弱毒疫苗和灭活疫苗。其中，弱毒疫苗在使用过程中可能会出现毒力增强的现象，相比之下灭活疫苗或基因工程疫苗安全性更高。做好现有疫苗的优化和新型疫苗的研发工作对于该病的防控尤为重要。陈少莺等[45]将能使MDEF产生病变的GPV疫苗株和MDPV疫苗株按适当比例混合，制成了MDPV-GPV二联弱毒疫苗，有效免疫期超过60 d，可以实现较好的免疫保护。程晓霞等[46]以MDPV弱毒株（MPV-P1株）和番鸭源GPV弱毒株（MDGPV-D株）为种毒，制备了MPV-GPV二联活疫苗，可诱导雏番鸭产生良好的免疫应答，并在免疫后7 d能抵御强毒株攻击。董嘉文等[47]将VP3基因和免疫刺激基序（CpG）克隆至真核表达质粒pIRES-d IL2中，构建了MDPV疫苗质粒，并成功在BHK-21细胞中表达，为MDPV核酸疫苗的研制奠定了基础。

5 综合防控

针对番鸭细小病毒病的防控，一是注重养殖场的生物安全防控体系建设。孵化、育雏、育成等各个区域需保持一定安全距离。引进种群需了解其健康状况和疫苗免疫情况，并提前调查了解来源地鸭病的流行状况。新入鸭群需隔离饲养，可对常见病进行抽检，保证健康后可集中进行饲养或混养。二是保证环境卫生，提高饲养管理水平。养殖场应保证圈舍及周围环境的卫生，做好定期消毒。需对人员和车辆出入进行严格把控，在大门口和养殖的不同区域设置相应消毒区，严格禁止闲杂人员进入养殖场。提高饲养管理水平，保证营养供给全面，避免出现饲料霉变和虫鼠污染等情况。三是重视野鸟在疫病传播中的作用。我国存在3条野鸟迁徙路线，野鸟在家禽疫病的传播和流行中发挥着重要作用。姚雨欣[48]在大雁、白鹭、鹤类和雀类的肠道中均检测到细小病毒科病毒，这提示要做好场舍的密闭式管理，减少养殖动物与野生鸟类接触的机会。四是做好洗消工作。应特别注意孵化环节，尤其是冬春季节，在利用生石灰和双氧水分别进行地面和环境及部分仪器消毒的同时，应注意环境通风，保证空气新鲜。五是做好疫病监测，推进疫病净化工作。在做好免疫的同时，定期进行病毒检测，尤其是祖代种群，应淘汰病原阳性个体，实现病原净化。