非洲猪瘟病毒载体疫苗研究进展

宋芳芳，刘春菊，任炜杰，迟田英，王志亮

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种烈性传染病，是世界动物卫生组织公布的法定报告动物疫病之一，是我国的一类动物疫病。世界动物卫生组织ASF形势报告显示，2020年前ASF就已在全球32个国家流行，感染超100万头家猪和超2.8万头野猪，给全球生猪产业带来了严重影响[1-3]。

ASFV为双链DNA病毒，作为非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）家族的唯一成员，有超过150个编码区，大小从170 kb到190 kb不等[4]。病毒粒子直径约为250 nm，由中心类核、内脂蛋白膜、二十面体蛋白外衣壳和外脂蛋白包膜组成[5]。ASFV在细胞内外均具有传染性，且在环境中具有很强的生存能力[6]。作为目前全球生猪产业发展最为严重的威胁之一[1-2]，ASF至今仍无有效治疗手段，也没有可提供广泛交叉免疫反应的疫苗，因此开发一种有效的ASFV疫苗迫在眉睫。

ASFV疫苗可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、病毒载体疫苗、哺乳动物表达质粒或几种疫苗的组合。病毒载体疫苗是指将致病微生物的免疫保护性基因插入到载体病毒的非必须区构建重组病毒，经培养后制备的疫苗[3]。病毒载体疫苗能稳定诱导抗原特异性的体液免疫和细胞免疫反应，可作为ASF防控技术研发的重点方向。本文综述了基于不同病毒载体的ASFV疫苗研究进展，以期为推进ASF病毒载体疫苗研究及进一步研发具有高度保护潜力的ASFV疫苗提供参考。

1 病毒载体疫苗概述

病毒载体疫苗（Viral vector vaccines）是由Jackson等[7]提出的一种利用基因编辑后没有毒性的病毒作为载体，递送免疫原的新型疫苗开发技术。优化后的病毒载体可提高基因组的包装能力和复制能力，同时增强病毒的细胞趋向性，可用于定制特定的免疫反应[8]。现已有多种病毒被应用于相关病毒载体疫苗的开发，如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、痘病毒、甲病毒、沙粒病毒、疱疹病毒和横纹肌病毒等[9]，各病毒载体均有其自身优缺点，载体病毒不同，其疫苗的具体性质也不同。

病毒载体疫苗综合了DNA疫苗和减毒活疫苗的优点，既可像DNA疫苗一样携带DNA进入宿主细胞，诱导抗原蛋白，引发系列免疫反应，又可像减毒活疫苗一样在体内复制[10]。此外，病毒载体疫苗安全性较高，研发时可通过使用免疫原基因去除或替换病毒载体中的毒力基因，或者通过破坏病毒载体的复制能力确保安全性。此外病毒载体编码的免疫原还可作为标记物，用于区分感染动物与疫苗接种动物。病毒载体同样具有缺点，如生产过程复杂[11]，可诱导宿主产生针对载体病毒本身的中和抗体[12]及无法使用相同技术重复接种[13]，针对上述问题，现已通过采用相关策略进行克服，如将抗原纳入衣壳而产生嵌合载体[14]，或构建共价修饰型和辅助病毒依赖型载体等[15]。因此，病毒载体疫苗仍是一种有着较大发展潜力且可广泛适用的疫苗开发平台。

2 不同病毒载体疫苗发展现状

2.1 杆状病毒载体

杆状病毒（BacMam）是杆状病毒科的双链包膜DNA病毒，是目前研究最多的昆虫病毒之一，也是最早被用作传递靶向基因制造ASF诊断药物和疫苗的载体[16]。BacMam系统具有包装容量大且易于生产的优势。

Carrascosa等[17]利用BacMam载体表达p12蛋白免疫家猪，结果发现纯化重组p12免疫的猪并未对ASF产生保护性免疫作用。Ruiz-Gonzalvo等[18]则构建了携带ASFV血凝素（HA）基因的重组BacMam疫苗，发现疫苗接种后可刺激机体产生与ASFV感染恢复期动物体内相似的保护性抗体。Gómez-Puertas等[19]利用BacMam载体表达p54和p30蛋白发现：接种p54或p30 BacMam疫苗的猪并未受到保护，其疾病进程也无显著变化；但接种了p54/p30融合蛋白BacMam载体疫苗免疫的猪，其疾病进程则发生了显著改变。这可能是因为上述疫苗同时刺激了病毒中和的两种机制。Argilaguet等[20]用BacMam-sHAPQ，即一种编码p30、p54和分泌性血凝素（sHA）的BacMam结构，对猪先免疫再攻毒，发现2/3的免疫猪体内无病毒，这也证明了T细胞在预防ASF方面的关键作用。

BacMam载体在ASFV载体疫苗研究中较为常用，可能与其可获得良好的黏膜免疫效果相关[21]。Heimerman等[22]还证明了BacMam载体在制备针对p72重组抗原片段单克隆抗体方面的有效性。

2.2 牛痘病毒载体

改良后的安卡拉牛痘病毒（MVA）可编码一种或多种外源抗原，并可引发体液免疫和细胞免疫反应，具有固有的佐剂特性。大量临床试验已证实了MVA载体疫苗的安全性和有效性[23]。

Lopera-Madrid等[24]通过MVA载体系统，递送表达ASFV的免疫保护性相关抗原，结果发现构建的相关亚单位疫苗均可诱导接种猪的T细胞反应并刺激相关抗体的产生。此外，Lopera-Madrid[25]还指出如何通过选择启动子获得相关免疫原性抗原的高表达，这可能是未来开发以MVA为递送载体的ASFV亚单位疫苗的研究方向。

由于MVA载体疫苗可使免疫猪稳定获得对ASFV各抗原蛋白的T细胞、B细胞免疫应答，因此利用MVA载体递呈ASFV抗原复合物，以加强免疫效果，提供稳定的保护性免疫能力，使免疫猪可以对抗同源和异源ASFV感染，将是未来开发ASFV疫苗的候选策略之一[26]。

2.3 甲病毒载体

甲病毒属于Togaviridae家族的RNA正义单链病毒，可在宿主细胞的细胞质中复制，作为疫苗载体可消除病毒基因整合到宿主基因组中的可能。甲病毒载体疫苗目前已被用作开发针对各种病毒、细菌、原生动物和肿瘤抗原疫苗的平台[27]。被用于疫苗构建的甲病毒载体包括委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）、辛德比斯病毒（SINV）、塞姆利基森林病毒（SFV）以及VEEV-SINV。

现已证实基于甲病毒载体的疫苗对猪的几种病毒性疫病（包括ASF）安全有效[25]。Murgia等[28]利用甲病毒载体将ASFV抗原复制子颗粒（RP）传递给猪并检测猪Vero细胞中ASF抗原p30（RP-30）、p54（RP-54）和pHA-72（RP-sHA-p72）的表达和免疫原性。结果显示，p30表达量最高且免疫原性最强，随后分别是p54和pHA-72，体现出体外蛋白表达与体内免疫原性间的相关性。后续可通过预测RP结构并分析其免疫原性，构建甲病毒载体疫苗，以增强对ASFV表位的识别。

2.4 腺病毒载体

腺病毒是一种具有遗传多样性的DNA病毒，可在多种动物以及人类中引起眼、呼吸道或胃肠道上皮的非致命性感染。作为可将基因或抗原递送到目标宿主组织的优良载体，腺病毒载体同样是最常用的重组疫苗候选载体之一。

Lokhandwala等[29-30]评估了两种ASFV多抗原混合物活载体疫苗的免疫原性和安全性，其中表达结构抗原（p32、p54、pp62和p72）的腺病毒混合物免疫猪后可诱导IgG、IFN-γ + T细胞和CTL响应，利用腺病毒载体递呈新型ASFV抗原混合物A151R、B119L、B602L、EP402R1PRR、B438L、K205R和A104R，免疫猪后也得到了相同结果。Goatley等[31]发现ASFV基因B602L、B646L、CP204L、E183L、E199L、EP153R、F317L和MGF5055R，在使用人腺病毒5（rAd）和Ankara重组修饰疫苗递呈并接种猪后，可以保护猪抵御致死剂量ASFV的感染。Liu等[32]对小鼠和猪进行肌肉和鼻腔接种携带不同抗原的ASFV腺病毒载体疫苗混合物，均取得了较好的免疫效果，且可为养殖猪提供高效的免疫保护，同时未观察到抗原间的显著干扰，这进一步证实了ASFV腺病毒载体疫苗的安全性和有效性。

相较于减毒疫苗，相关ASFV腺病毒载体疫苗虽可诱导有效的抗原特异性免疫反应，但其在ASFV强毒感染后显示出的保护效果可能依旧有限[33]。未来ASFV新的潜在保护性抗原的挖掘将对基于腺病毒载体ASFV疫苗的开发和保护性免疫效果的增强至关重要。

2.5 慢病毒载体

慢病毒（LV）表达载体能在细胞中稳定持久的表达被转染基因，且表达的相关蛋白能诱导出抗原特异性的免疫应答反应，是常用的病毒载体[34-35]，也是稳定转移基因到真核细胞的可靠工具[36]。与来源于肿瘤逆转录病毒的载体不同，LV表达载体可为原代细胞提供稳定的基因递送，且表现出低免疫原性。此外，在LV系统表达的蛋白泛素偶联酶（UBCv1），是目前已知的唯一由病毒编码的偶联酶，可调节宿主先天免疫和炎症信号的传递，并在机体抗病毒反应的形成中起重要作用[37]。

在ASF基因工程中使用LV的报道较为有限。De Oliveira等[38]在研究中首次发现了ASFVI329L基因在LV系统中表达的可能性，该基因可以用于编码细胞膜及其表面的糖基化蛋白，抑制dsRNA刺激的NFκB和IRF3激活，从而调节宿主先天免疫，表明研发I329L基因缺失苗是研发ASFV疫苗的候选策略。Zhang等[39]成功在LV系统中表达ASFV DP71L蛋白，证明了DP71L在静息细胞中可以引起真核翻译起始因子2α（eIF2α）的去磷酸化，并可增强共转染报告基因的表达。Masujin等[40]利用LV系统将SV40大T抗原（SV40LT）和猪端粒酶逆转录酶（pTERT）基因导入原代猪肾巨噬细胞，最终获得了一种具有中晚期巨噬细胞表型特征的永生化细胞系。该细胞系具有抗ASFV感染的能力，并适用于多种ASFV体外检测。

3 结语

目前已证实，杆状病毒、腺病毒、甲病毒和牛痘病毒载体均可诱导有效的ASFV抗原特异性反应，但在ASFV感染特别是强毒感染后，基于现有免疫原的病毒载体疫苗显示出的保护作用仍较为有限。未来可通过继续发掘ASFV新型免疫原，并结合对相关病毒载体的优化改造，研发出防治效果更加优异的ASFV疫苗，争取早日全面战胜ASF疫情。