HPLC法测定坤宁颗粒中柚皮苷的含量

程盟玲，何 鹏

(芜湖市食品药品检验中心，芜湖 241000)

坤宁颗粒是由益母草、当归、赤芍、丹参、枳壳等 11 味中药加一定的赋形剂，经提取、浓缩、干燥后制成的具有活血行气、止血调经功效的中药颗粒剂[1]。对于妇女气滞血瘀，出现月经过多、经期延长等临床症状者，坤宁颗粒能明显缩短出血时间，具有很好的促凝作用，集调经和止血于一体，既治标又治本，达到止血调经的效果。研究表明，坤宁颗粒中有四百多种成分，而其发挥抗凝血活性的 Q-Marker以及治疗异常子宫出血的物质基础可能就是芍药苷、丹酚酸B、新橙皮苷及柚皮苷等成分[2]。丹酚酸B来自丹参，芍药苷来自赤芍，新橙皮苷与柚皮苷均出自枳壳。枳壳作为臣药，用量较大，而目前该颗粒的质量标准为YBZ10452005-2015Z，主要控制组方中赤芍的芍药苷含量，辅以橙皮苷、盐酸水苏碱等成分对枳壳、益母草等药味进行定性鉴别，均没有对枳壳的有效成分如橙皮苷、柚皮苷等进行含量监测[3]。为了对坤宁颗粒的质量进行更好的监测，本文建立HPLC方法，以柚皮苷计测定枳壳的含量，判断坤宁颗粒中枳壳药材的真伪优劣。该方法操作简单易学，速度快，重现性好，具有很强的实用性。

1 仪器与试剂

高效液相色谱仪：岛津LC-20AT；PDA检测器：岛津SPD-M40；分析天平：梅特勒-托利多XP205、梅特勒-托利多ME36S；水为超纯水；乙腈为色谱纯，甲醇以及磷酸为分析纯；柚皮苷对照品：中检院，110722-202116，含量以93.5%计；坤宁颗粒样品：药房购买，生产厂家为合肥立方制药股份有限公司，每袋装 15 g，批号220109、220701、2208011、2209009。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：岛津SHIMSEN Ankylo C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：35 ℃；波长：283 nm；以乙腈-0.1%磷酸溶液(0～25 min：16∶84；25～27 min：16～35∶84～65；27～32 min：36∶65)为流动相；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

取柚皮苷对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成 25.67 μg/mL 的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取研细后的样品粉末 1 g，置锥形瓶中，精密加入80%甲醇 50 mL，称重，超声(功率 200 W，频率 30 kHz)30 min，冷却后称重，用80%甲醇补足减少的质量，过滤，取过滤液，即得。

2.4 试验与结果

2.4.1 重复性试验

取同一批号(220109)坤宁颗粒，按“2.3”制备6份供试品溶液，按“2.1”分别测定，计算柚皮苷的含量，RSD=0.9%，该方法重复性良好，符合检测需求。试验结果见表1。

表1 重复性试验结果

2.4.2 精密度试验

取“2.2”项下对照品溶液，按“2.1”连续测定6 次，记录柚皮苷峰面积值，RSD=0.3%，仪器精密度较好，符合检测需求。结果见表2。

表2 对照品溶液的精密度试验结果

2.4.3 线性

取柚皮苷对照品，精密称取 10.98 mg，置 100 mL 容量瓶中，加80%甲醇溶解至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密吸取对照品储备液，按照表3方法制成6种质量浓度的对照品溶液；取上述6种对照品溶液，按“2.1”分别测定，以质量浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积值为纵坐标，作标准曲线，柚皮苷在5.13～102.66 μg/mL 范围内具有良好的线性关系[4]。回归方程为Y=15223.662X+2947.521，R2=1.000。结果见表3、图1。

图1 标准曲线图

表3 标准曲线数据

2.4.4 加样回收试验

取已知含量(批号220109，质量分数为 1.52 mg/g)的坤宁颗粒，研细，取样品 1 g，对照品 3 mg，精密称定，置同一具塞锥形瓶中，按“2.3”平行制备6份加标溶液，按“2.1”分别测定，计算加样回收率，结果RSD=1.3%，本方法具有良好的回收率，符合检测需求。试验结果见表4。

表4 回收试验结果

计算公式：

(1)

2.4.5 专属性试验

阴性对照液的制备：取坤宁颗粒组方除枳壳外其他药味，按照坤宁颗粒工艺方法，制成阴性样品，取该样品1 g，按“2.3”制备阴性对照液。

取“2.2”项下的对照品溶液、阴性对照液和“2.1”项下1号供试品溶液，按“2.1”分别测定[5]。结果表明，在同一保留时间，供试品与对照品色谱均出现色谱峰，在相应位置上，阴性对照色谱未出现色谱峰。表明其他药味中的成分对测定柚皮苷无干扰作用。色谱图见图2。

图2 HPLC色谱图

2.4.6 稳定性试验

取坤宁颗粒样品，按“2.3”制成1份供试品溶液，分别测定并记录 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 时供试品中的柚皮苷峰面积值，结果RSD=0.3%，表面供试品溶液中的柚皮苷含量在 24 h 内无明显变化，具有良好的稳定性，可以满足测定要求。试验结果见表5。

表5 不同时间测定供试品中柚皮苷的峰面积

2.4.7 定量限考察

取“2.2”项下的对照品溶液，用80%甲醇逐级稀释，制成低浓度的溶液，按“2.1”测定，直至待测成分的仪器信噪比(S/N)约为10∶1，取此时对照品溶液的浓度为定量限[6]。结果柚皮苷的定量限为 3.72 μg/mL。

2.5 样品含量测定

取不同批号(批号220701、2208011、2209009)的坤宁颗粒，每批样品分别按“2.3”平行制备2份供试品溶液，按“2.1”测定，计算，结果见表6。

表6 样品含量测定结果(mg/g)

3 讨论

3.1 指标成分的选择

本实验目的是建立监测坤宁颗粒中枳壳含量的方法，通过查阅文献可知，枳壳中含有较多的黄酮类物质，包括橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、木犀草素等多种成分[7]，其中橙皮苷与柚皮苷作为枳壳的有效成分及活性物质，一定程度上反应了枳壳的质量优劣[8]，均可作为本研究的指标成分，前期实验时发现样品经甲醇提取后橙皮苷、木犀草素等含量较少，柚皮苷则较多，所以选择柚皮苷作为坤宁颗粒中枳壳的指标成分进行测定。

3.2 色谱条件选择

波长：预实验中，采用PDA检测器对柚皮苷对照品进行光谱扫描，通过光谱图显示的最大吸收，同时参考《中华人民共和国药典》2020年版中枳壳以及其他含枳壳的中成药含量测定的方法，将波长定为 283 nm。

流动相：预实验中，选择甲醇作为有机相，水、3%冰醋酸溶液作为水相，考察不同比例下样品主峰的分离度，峰形与分离度均无法达到要求。后将有机相换成乙腈，水相换成不同浓度的磷酸溶液，峰形有了较大改善，等度时分离度依然无法达到要求。采用乙腈-磷酸系统梯度洗脱时，磷酸溶液浓度过高或者过低，均会导致色谱峰前拖严重。最终采用乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱的方式，此时峰形与分离效果均达到最佳状态。

色谱仪：分别使用安捷伦1260、赛默飞3000进行进样分析，结果不同仪器色谱峰分离度均不小于1.5，峰形良好，符合测定要求。

3.3 提取条件选择

提取溶剂：预实验中考察了使用乙醇、稀乙醇、甲醇、80%甲醇以及50%甲醇等溶剂的提取效果。使用乙醇与稀乙醇提取时，提取液 24 h 内不稳定，产生浑浊。使用甲醇提取时，不同浓度下柚皮苷提取量差别不大，80%甲醇提取量略多于其他，所以选择80%甲醇作为最终的提取溶剂。

提取方法及时间：预实验中考察了静置过夜、振摇、加热回流以及超声提取等多种提取方法。静置过夜与振摇同其他两种方法相比提取效果较差，而加热回流与超声的提取效果相似，超声提取简单快捷，容易操作，所以选择超声提取。比较超声提取 30 min、45 min 及 60 min，柚皮苷提取量相当，无明显变化，所以选择超声提取 30 min。

3.4 方法评价

本方法中建立的HPLC法操作简便，经方法学考察，重复性和分离度符合要求，准确度和稳定性良好，符合检测需求，为进一步完善坤宁颗粒的质量标准提供了借鉴。