青花椒总生物碱对金黄色葡萄球菌抑菌活性研究

张文艳，李俊杰，艾玲松，李茂东，赵仲霞，师 睿*

1.昭通学院化学化工学院，云南 昭通 657000；2.云南三鑫职业技术学院医药健康学院，云南 文山 663000

天然防腐剂具有良好的广谱抑菌性，且安全无毒、无味，是理想的食品防腐剂的必要条件[1]。花椒中的黄酮[2]、挥发油和生物碱类[3]等多种活性物质能有效抑制食品中常见微生物的生长与繁殖。本文拟对昭通金江青花椒总生物碱的体外抑菌活性进行研究，以期为新型天然防腐剂的开发提供实验依据，也为金江青花椒的精深加工提供理论依据，共同助力金江青花椒产地脱贫攻坚。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

青花椒：昭通市鲁甸县花椒，烘干至恒重，粉碎后过0.250 mm 孔径筛，于干燥器中避光保存；营养肉汤培养基、营养琼脂固体培养基、PBS 缓冲液，Solarbio；金黄色葡萄球菌显色培养基，海博生物；ATP 含量测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；TD-400 台式低速自动平衡离心机，上海佑科仪器仪表有限公司；DHP-9082 电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；P1000 型移液枪，大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；PT-3502 C 全波长酶标仪，北京普天新桥技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 青花椒总生物碱的提取制备

参照张文艳[4]、石雪萍[5]、郑丹等[6]的酸性染料比色法提取花椒生物碱。将青花椒生物碱提取后浓缩成浸膏，质量浓度配置为800 mg/mL，过滤除菌后置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 菌种的活化及菌悬液的制备

在无菌环境下，将冻存的金黄色葡萄球菌S.aureus 接种到营养肉汤培养基中，在37 ℃，150 r/min 的条件下活化3 次，直至达到最佳生长状态，然后备用。参考张可鑫等[7]的方法，采用二倍稀释法将S.aureus 制成108 CFU/mL 的菌悬液备用，并进行后续实验。

1.2.3 滤纸片法测定抑菌圈直径

取1 mL 菌悬液涂于营养琼脂固体培养基后将6 mm 滤纸片按梅花形贴在培养基表面，使滤纸片和培养基表面完全接触。吸取15～20 uL 青花椒总生物碱提取液滴在滤纸片表面，对照组为无菌蒸馏水，每组三个平行。在30 ℃的条件下放置24 h 后取出观察，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，求其平均值。药敏试验判定标准[8]：抑菌圈直径≥20 mm 为高敏，15 mm≤抑菌圈直径＜20 mm 为中敏，10 mm≤抑菌圈直径＜15 mm 为低敏，10 mm 以下为不敏感。

1.2.4 最小抑菌浓度（MIC）的测定

采用二倍稀释法，以800 mg/mL 的青花椒提取物为母液，S.aureus 菌悬液菌液为稀释液，稀释青花椒提取物，使青花椒提取物的最终质量浓度分别为6.25、12.5、25、50、100 mg/mL。因培养基和青花椒提取物均具有一定的吸光性，设置以下组别：空白对照为培养基，阴性对照为不加药物的菌液，药物对照组为无菌水加入等浓度的提取物，所有组别均设置三个平行组，于30 ℃条件下培养24 h 后，用酶标仪测定600 nm 波长处的吸光度。

1.2.5 生长抑制曲线的测定

参考1.2.4 的方法，使药物终浓度为1/8×MIC和1/4×MIC，于30 ℃条件下培养24 h，每隔2 h 在600 nm 下检测其吸光值，并绘制其生长抑制曲线。

1.2.6 ATP 含量的测定

将青花椒总生物碱按1×MIC 的比例加入对数期的金黄色葡萄球菌菌悬液培养基中。以无菌水作空白对照，将菌液和培养基按1∶1 比例混匀后作为阳性对照。设定取样时间间隔为1 h[9]，将取出的样品在6 000 r/min 下离心10 min，用PBS 洗涤并重悬菌体三次，接着，在300 W，间隔1.1 s 的条件下破碎细胞，随后于8 000 r/min 冷冻离心10 min，吸取上清液，最后，参照ATP 测试盒的测定方法[10]检测样品中ATP 的含量。

1.2.7 青花椒总生物碱对S.aureus 抑菌稳定性的研究

以S.aureus 为指示菌，使用青花椒总生物碱质量浓度为800 mg/mL，进行三次平行实验。参考1.2.3 的方法，检测在不同处理条件下青花椒总生物碱对S.aureus 抑菌活性的影响。

1.2.7.1 温度对青花椒总生物碱抑菌稳定性的影响

参考罗晓东等[11]的方法，实验组把青花椒总生物碱分别放在以下温度水浴30 min：40、50、60、70、80、90、100、121 ℃，对照组为30 ℃，每组三个平行。

1.2.7.2 金属离子对青花椒总生物碱抑菌稳定性的影响

参考宋姗姗等[12]的研究方法，实验组将青花椒总生物碱分别浸泡在0.1 mol/L-的NaCl、KCl 和CaCl2溶液中3 h 后进行抑菌圈实验，对照组则使用未经处理的青花椒总生物碱。

1.2.7.3 pH 对青花椒总生物碱抑菌稳定性的影响

参考原江锋等[13]的方法，使用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 溶液调节pH。实验组将青花椒总生物碱分别调节为以下pH：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；阳性对照为未做处理的青花椒总生物碱；空白对照为1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 溶液。

1.2.7.4 紫外线对青花椒总生物碱抑菌稳定性的影响

实验组用30 W 紫外灯分别照射10、20、30、40、50、60、70 min 青花椒总生物碱，对照组为未做处理的青花椒总生物碱。

1.3 数据分析

实验数据采用Excel 2016、SPSS 26 统计软件和Graphpad Prism 6 软件进行处理与分析，结果以（±s）表示。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈直径测定

由表1，图1 可知，800 mg/mL 的青花椒总生物碱作用于S.aureus 后，抑菌圈平均直径为22.75 ±1.54 mm，达到高度敏感，这表明青花椒总生物碱对金黄色葡萄球菌具有强抑制作用。

图1 金黄色葡萄球菌抑菌圈

表1 金黄色葡萄球菌抑菌圈直径

2.2 最小抑菌浓度（MIC）

由图2 可知，25 mg/mL 青花椒总生物碱作用于S.aureus 后抑菌率高于90 %，故MIC 值为25 mg/mL。

图2 青花椒总生物碱对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度

2.3 青花椒总生物碱对S.aureus 生长的影响

由图3 可知，1/4 MIC 和1/8 MIC 青花椒总生物碱作用于S.aureus 后均会抑制其生长。

图3 金黄色葡萄球菌生长抑制曲线图

2.4 金江青花椒总生物碱对金黄色葡萄球菌ATP含量的影响

ATP 是细胞能量转换的载体，细胞的功能随着其水平的改变而改变。由图4 可知，随着青花椒总生物碱作用于S.aureus 时间的延长，其中ATP 含量呈降低趋势。

图4 金黄色葡萄球菌中ATP 含量

2.5 青花椒总生物碱对S.aureus 抑菌稳定性的影响

2.5.1 温度对青花椒总生物碱抑菌稳定性的影响

由表2 可知，随着温度的上升，青花椒总生物碱的抑菌效果逐渐下降，说明温度对其抑菌活性有一定的影响。但从整体来看，青花椒总生物碱在40 ～90℃仍具有较强的抑菌活性，说明青花椒总生物碱的抑菌效果不易受温度影响。

表2 不同温度处理对青花椒总生物碱抑菌稳定性的影响

2.5.2 金属离子对青花椒总生物碱抑菌稳定性的影响

由表3 可知，不同金属离子对青花椒总生物碱抑菌活性的影响较小。

表3 不同金属离子对青花椒总生物碱抑菌稳定性的影响

2.5.3 pH 对青花椒总生物碱抑菌稳定性的影响

由表4 可知，pH 越高，花椒总生物碱的抑菌效果愈强，在pH=10 时，抑菌圈直径达到了21.08±0.17 mm。且由空白对照可知，其抑菌效果的增强与单纯碱性试剂无关。原因可能是，在碱性环境下花椒总生物碱发生了协同效应，其抑菌活性大大增强。由此可以证明花椒总生物碱的稳定性较好，可在碱性环境下使用，且抑菌效果更突出。

表4 pH 对金江花椒总生物碱抑菌稳定性的影响

2.5.4 紫外线对青花椒总生物碱抑菌稳定性的影响

如表5 可知，青花椒总生物碱经不同时长紫外线照射之后，其抑菌效果变化不大，说明青花椒总生物碱对紫外光相对较稳定。

表5 紫外线处理对花椒总生物碱抑菌稳定性的影响

3 结论

将青花椒总生物碱作用于S.aureus 后，测定其抑菌圈直径、MIC 值、生长抑制曲线、培养液中ATP含量，确定青花椒总生物碱对S.aureus 的有抑制效果，并检测青花椒总生物碱的抑菌稳定性。实验结果显示，青花椒总生物碱作用于金黄色葡萄球菌后，抑菌圈直径为22.75±1.54 mm，MIC 值为25 mg/mL，生长明显受到抑制，且ATP 含量下降；药物稳定性检测结果也表明青花椒总生物碱的抑菌稳定性较好。综上所述，青花椒总生物碱对S.aureus 的生长繁殖具有显著的抑制作用，有望依此研发新型天然抗菌剂。