多黏菌素E甲磺酸钠的色谱指纹图谱与质量一致性研究

李 宣，黄敏文，周 杰，袁耀佐，杭太俊

（1江苏省食品药品监督检验研究院，南京 210019；2国家药品监督管理局化学药物杂质谱研究重点实验室，南京 210019；3中国药科大学药物分析教研室，南京 210009；4正大天晴药业集团股份有限公司，连云港 222062）

随着全球耐药问题的日益严峻，多黏菌素类药物成为临床上治疗严重革兰氏阴性耐药菌感染的最后一道防线[1]，同时也被WHO 列为最高优先至关重要的抗微生物药物。多黏菌素E 甲磺酸钠（colistimethate sodium，CMS）与其他类抗生素或抗菌药不会产生交叉耐药性，是当前治疗多重耐药铜绿假单胞菌及其他革兰氏阴性菌引起感染的首选药物。目前多黏菌素E 甲磺酸钠在国外使用广泛，在欧洲、美国、日本、泰国[2]等相继上市，在国内，江苏正大天晴药业首先进行仿制并获得了国家药品监督管理局的上市批准。

多黏菌素E 甲磺酸钠是多黏菌素E (polymyxin E，colistin)发生不同程度甲磺酸化后的半发酵半合成化合物，多黏菌素E 本身为一种混合物，其成分较复杂，主要组分为多黏菌素E1 和E2，因此CMS主要组分为多黏菌素E1 甲磺酸钠（CMS E1）和多黏菌素E2甲磺酸钠（CMS E2）。原研原料药与国产仿制药在发酵及提取纯化工艺、合成工艺、纯化分离等诸多方面存在不同，为了考察两者质量一致性，进一步确保药物安全性与有效性，需建立质量一致性评价方法及指标，加强对该产品的质量控制。

EP10.3[3]、USP43[4]和JP18[5]均收载了多黏菌素E甲磺酸钠，仅EP控制了组分和有关物质。然而多黏菌素E甲磺酸钠为复杂组分抗生素，除了EP收载的6 个特定组分（CMS E1ASM8、CMS E1ASM6、CMS E1ASM4、CMS E2ASM8、CMS E2ASM6、CMS E2ASM4）之外，还有近百个结构相似和理化性质相似的组分，这些组分同样具有抗菌效果。现行质量标准受方法开发难度所限，仅选择控制了六个指标性组分的相对含量以及来源于多黏菌素E1和多黏菌素E2 组分的总含量，然而这种代表性组分的选择是存在一定随机性的，无法涵盖所有组分的具体情况，因而也缺乏疗效相关性。

对复杂组分抗生素的质量一致性评价，如何选择合适的方法进行全面评价一直是一个难点。以本文研究对象多黏菌素E甲磺酸钠为例，仅以几个指标性组分而忽略近百个其他组分来判断仿制药与原研药的一致性是不充分的。为了弥补欧洲药典对多黏菌素E 甲磺酸钠众多组分及有关物质的结构与归属研究的不足，本研究在EP10.3 描述的色谱条件基础上，建立了二维液质联用技术结合数据库的方法，首次成功地实现了对组分及有关物质的研究。通过所建立的方法快速高效地推定了CMS 中99 个化合物的结构，对组分及有关物质进行了较为全面深入的研究。通过对多黏菌素E 甲磺酸钠中的成分峰进行了结构推定及来源归属，确定其组分峰有47 个。若将每个组分峰的含量进行逐一对比，虽然数据更加全面，但是对于动辄近百个组分的复杂抗生素而言，工作量较大，需要结合其他更为整体、准确的评价手段，因此，本研究引入了指纹图谱。

在中药质量控制领域广泛采用的指纹图谱技术，是中药常用的质量控制手段[6-8]。指纹图谱能较为全面地反映复杂组分药物及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。相似度评价软件可以对样品指纹图谱和对照指纹图谱进行整体比较获得相似度结果，进而进行一致性评价。目前常用的相似度评价软件是国家药典委员会发布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，该软件采用自主编程，利用夹角余弦算法，将指纹图谱导入软件，表征各样品间相似程度，进而评价不同产地中药质量[9]。相似度范围从0 到1，数值越大表明样品间相似程度越高，该评价系统操作简便且结果可靠。

多黏菌素E 甲磺酸钠具有众多且复杂的彼此相似的有效组分，与中药具有类似的特点，仅通过测定6 个特征组分的含量并不能全面反映多黏菌素E甲磺酸钠的质量，建立全面系统的特征性指纹图谱也是一种进行质量评价的有效手段。基于此思路，本研究将特征组分的含量与指纹图谱相似度评价相结合，能够更为准确地对不同来源的多黏菌素E甲磺酸钠样品进行质量一致性评价。

1 材 料

1.1 药品与试剂

无水磷酸氢二钠（美国Aladdin 公司，色谱纯）；50%氢氧化钠溶液（Thermo Fisher Scientific 公司，色谱纯）；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）（德国Merck公司）；多黏菌素E甲磺酸钠原料药（A企业：Xellia 公司的进口原研原料药，批号为A1680958；B 企业：江苏正大天晴有限公司的国产仿制原料药，批号为11121011），多黏菌素E 甲磺酸钠制剂（江苏正大天晴有限公司：无菌灌装制剂，批号210927148；冻干制剂，批号190405115；Xellia 公司：批号190201，批号190202，批号190203），Milli-Q超纯水（美国Millipore公司）。

1.2 仪 器

Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪（美国Waters 公司），Milli-Q 超纯水机（美国Millipore 公司）；XS205 万分之一电子天平（美国Mettler Toledo公司）。

2 方 法

2.1 色谱条件

采用Acquity UPLC®Peptide CSH C1（82.1 mm ×150 mm，1.7 µm）色谱柱，以磷酸盐缓冲液（7.8 g/L磷酸二氢钠，用1 mol/L氢氧化钠调节pH至6.4）-乙腈（19∶1）为流动相A，磷酸盐缓冲液-乙腈（1∶1）为流动相B，流速为0.3 mL/min，柱温30 ℃，检测波长为210 nm，进样量2 µL。梯度洗脱程序见表1。

Table1 Gradient elution program

2.2 溶液配制

供试品溶液的制备：分别取多黏菌素E甲磺酸钠原料药（原研原料药/仿制原料药）20 mg，加水0.5 mL溶解，用甲醇稀释至10 mL。

2.3 组分含量测定

取原研原料药供试品溶液及仿制原料药供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，按面积归一化法计算各组分峰的含量。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度 取同一份供试品溶液连续进样5次，采用峰面积归一化法，考察6 个特定组分峰的相对保留时间和峰面积百分比。

2.4.2 重复性 制备供试品溶液5份，按“2.1”项色谱条件下进样分析，采用峰面积归一化法，考察6个特定组分峰的相对保留时间和峰面积百分比。

2.4.3 稳定性 取同一份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下分别于0、4、6、8、24 h 进样（进样室温度：7 ℃），考察6 个特定组分峰的相对保留时间和峰面积百分比。

2.5 指纹图谱的采集及相似度分析

记录原研原料药与仿制原料药的色谱图，将所有峰进行积分，导出cdf 数据文件，采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”对色谱图进行匹配，将色谱图导入软件，多点校正进行全谱图匹配，参数设置为峰面积占总峰面积的0%以上的峰参与匹配，且时间窗宽度设置为0.05，计算色谱图的相似度。

3 结 果

3.1 指标性组分含量对比

多黏菌素E 甲磺酸钠是多黏菌素E 中含量较高的两种成分——多黏菌素E1 和多黏菌素E2 经甲磺酸化后由于取代基数量和位置不同而产生的一系列衍生物，主要分为多黏菌素E1 甲磺酸钠峰群和多黏菌素E2 甲磺酸钠峰群。根据EP 相关规定，多黏菌素E 甲磺酸钠中来源于多黏菌素E1 和多黏菌素E2 的峰归属于组分，其他则归为有关物质。本研究通过建立二维液质联用技术，同时对比多黏菌素E1 甲磺酸钠和多黏菌素E2 甲磺酸钠对照品色谱图中化合物的保留时间，确定多黏菌素E 甲磺酸钠中归属于组分的峰有47 个（图1）。结合拟合出的多黏菌素E 甲磺酸钠组分峰色谱图，考察原研原料药与仿制原料药中组分峰的含量（面积归一化法），并计算组分纯度（归属于多黏菌素E1 和多黏菌素E2 所有组分含量之和）。

Figure1 Fitting chromatogram of 47 peaks of colistimethate sodium (CMS)

由表2 可见，原研原料药和仿制原料药6 个指标性组分峰含量以及组分纯度均满足EP 要求，仿制原料药的组分纯度略高于原研原料药，6 个指标性组分中，仿制原料药中带有8 个取代基（CMS E2ASM8、CMS E1ASM8）和6 个取代基（CMS E2ASM6、CMS E1ASM6）的组分峰含量较原研原料药略高，带有4 个取代基（CMS E2ASM4、CMS E1ASM4）的组分含量较原研原料药略低，推测是由于两者在发酵及纯化工艺、合成工艺、纯化分离方法等方面存在的不同所致。虽存在一定差异，但差异较小，且除此之外，指标性组分个数均一致，通过指标性组分含量的对比可以从细节上判断两者质量的一致性。

3.2 指纹图谱方法学考察结果

3.2.1 精密度 同一份供试品溶液连续进样5次，6 个特定组分峰的相对保留时间的RSD 在0.05% ～ 0.10%，峰面积百分比的RSD 在1.97% ～2.95%，方法精密度良好。

3.2.2 重复性 5份供试品溶液进样分析，6个特定组分峰相对保留时间的RSD 均小于1%，峰面积百分比的RSD均小于3%，方法重复性良好。

3.2.3 稳定性 供试品溶液24 h（进样室温度：7 ℃）稳定性试验结果显示，随着时间增加各组分峰面积百分比变化较大，提示供试品应临用新制。

3.3 用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算色谱图的相似度

3.3.1 相似度考察 将色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，点击多点校正，进入校正状态，有助于减少不同谱图中同一色谱峰保留时间的误差后，进行全谱图匹配，结果显示仿制原料药中色谱峰保留时间、峰形与原研原料药中的色谱峰相匹配的峰约有近百个（图2）。

Figure2 Matching results of all peaks in the chromatograms of the original and imitated API (S1: Original API, S2: Imitation API)

3.3.2 相似度结果分析 将原研原料药与仿制原料药色谱图中所有色谱峰进行匹配，时间窗宽度设为0.05，由软件计算仿制相似度。若以原研原料药作为参比，则仿制原料药相似度计算结果为0.986，即从宏观角度来看原研原料药与仿制原料药色谱图相似度很高。

3.4 一致性评价结果

相似度结果范围从0 到1，数值越大表明样品间相似程度越高。原研原料药与仿制原料药色谱图相似度较高，但仅从指纹图谱的宏观相似度做判断具有一定的局限性，需要结合指标性组分含量对比结果，才能弥补对成分含量控制的不足。指标性组分含量测定结果显示，原研原料药与仿制原料药间差异较小，因此综合来看，原研原料药与仿制原料药质量基本一致，所存在的较小差异可能是由于二者在发酵及纯化工艺、合成工艺、纯化分离方法等方面存在的不同所致。

4 评价方法的应用

4.1 同一企业不同生产工艺对比分析

多黏菌素E 甲磺酸钠制剂生产工艺主要有两种：冻干及无菌灌装。B企业同时拥有两种生产工艺的制剂（无菌灌装制剂：S1；冻干制剂：S2），现对不同生产工艺制剂的质量进行对比分析。运用相似度法进行质量一致性评价（图3），若以S1作为参比，相似度结果为0.989，两者色谱图相似度高，色谱图中组分峰数量色谱行为一致，没有引入新的杂质。但指标性组分含量对比分析（表2）结果显示，峰面积（%）存在一定的差异。相比冻干制剂，无菌灌装制剂组分纯度较高，而且带有8个、6个取代基的化合物峰面积（%）略高，而带有4 个取代基的化合物峰面积（%）较低，表明生产工艺的不同对制剂各组分含量有一定的影响。

Figure3 Matching results of all peaks in the chromatograms of the Sterile filling and freeze-dry (S1: Sterile filling, S2: freeze-dry)

4.2 批间稳定性的考察

为了考察样品的批间稳定性，取A 企业的3批制剂（批号190201，S1；批号190202，S2；批号190203，S3）进行分析。运用相似度法进行质量一致性评价（图4），若以S1 作为参比，S2、S3 的相似度结果为0.999。指标性组分含量对比分析（表2）也结果显示各峰数量及组分纯度基本一致，且各组分峰面积（%）差距几乎没有差异，表明该企业制剂间具有较好的批间稳定性，生产工艺较为稳定。3批制剂间具有良好的稳定性。

5 讨 论

5.1 组分测定方法的选择

本研究所采用的组分测定方法是在EP10.3规定色谱条件的基础上稍微加以修改后的。在EP10.3 标准中，系统适用性中要求CMS E1ASM4与RRT 2.37 的色谱峰（与CMSE1ASM4 相邻）的峰谷比 ≥ 1.2，但EP10.3 规定的色谱条件下，较难满足系统适用性要求。通过改变流动相的pH（从pH 6.5 调至pH 6.4），提高了分离度，满足了系统适用性要求。优化后的色谱条件具有更好的分离能力，有效改善了目标组分峰及有关物质峰的分离效果，使组分/有关物质峰的定量更加准确，测定结果更加可靠，明显优于 EP 的方法。

5.2 起始物料多黏菌素E

多黏菌素E 本身为一种混合物，其成分较复杂，目前已知其至少包含多黏菌素E1、多黏菌素E2、多黏菌素E3 等不少于30 种化合物[10]，而多黏菌素E 甲磺酸钠也是这些成分中的胺基发生不同程度的磺甲基化之后形成的混合物。有文献[11]报道，多黏菌素E1和多黏菌素E2在抑菌活性上无明显差别，但二者混合物比单一成分的活性低，主要是因为二者会相互竞争血浆蛋白结合位点，影响游离药物浓度，进而影响药动学性质，同时还发现多黏菌素E1 对肾脏的毒性比多黏菌素E2 严重。多黏菌素E甲磺酸钠是一种无活性、毒性较低的多黏菌素E的前体药物，在体内水解为活性形式的多黏菌素E发挥作用[12-13]。

5.3 国内外原料药的制备差异

本研究所用的多黏菌素E 甲磺酸钠原研原料药的制备方法是由甲醛先与多黏菌素E 的5 个伯氨基形成Schiff 碱，然后再与过量的亚硫酸氢钠加成反应生成CMS。而国内仿制原料药在传统方法的基础上加以改进，将硫酸多黏菌素E 加水溶解，向其中加入甲醛溶液，将二者进行反应；再向上述的反应产物中加入亚硫酸氢钠溶液，继续反应，采用超滤膜进行分离纯化。该方法具有低污染，低能耗，工艺简单，重复性好，且所得产品的纯度和活性很高的优点。

5.4 复杂组分抗生素指标峰的选择

复杂组分抗生素存在大量组分峰和有关物质峰，在进行峰含量对比时，需要针对性地选择特征性指标峰，如被证明为主要起效成分的组分，或者是含量较高的主要组分。Xellia基于111个原料药批次的数据，对分别带有8、6 和4 个甲磺酸取代基的关键成分进行了评价，仅提出了6 个特征峰（CMS E1ASM8、CSM E1ASM6、CMS E1ASM4、CMS E2ASM8、CMS E2ASM6、CMS E2ASM4），分别为多黏菌素E1 或多黏菌素E2 带有8 个、6 个、4 个甲磺酸取代基。由于含有10个甲磺酸取代基的组分的不稳定性及其保留时间太短受干扰较多，因此未对该峰进行评价。由于CMS 的组分峰是相互依赖的（取代基多的组分含量减少会导致取代基少的组分含量增加)，因此对色谱图中选定的6 个峰的评价将提供关于CMS 质量及其与关键工艺参数和稳定性的相关性的足够信息[14]。在本研究中，选取了EP 中明确的6 个特征组分峰作为指标峰，能够提高一致性评价的效率。

5.5 相似度计算方法的选择

相似度计算方法包括以下几种：相关系数法、峰重叠率法（Nei 系数法）以及峰重叠率与共有峰强度结合法（改进Nei系数法）、夹角余弦法等。相关系数法是使用向量之间的相关系数来反映样品间的相似程度的方法[15]，取值范围较宽，且对大峰缺失表现得比较敏感，而对小峰缺失问题不够敏感。峰重叠率法（Nei 系数法）是根据待测样品与对照品共有峰数来反映相似度的分析方法，只考虑到图谱共有峰的数量问题，并未考虑共有峰其峰强度的影响[16]。峰重叠率与共有峰强度结合法（改进Nei 系数法）通过比较特征曲线的相似程度来判断中药的真假、优劣。此方法结合了峰强度信息，且无须对相对保留值数据进行标准化等预处理，但改进后仍对小峰缺失敏感而相对大峰不够敏感[17]。夹角余弦法是通过比较各向量之间的夹角余弦值来反映样本的相似度的方，该方法数字概念简单，数据处理过程简便快捷，在定量计算两张色谱指纹图谱相似度方面有其优势。本研究采用的国家药典委员会发布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”即采用夹角余弦法的计算方法，是目前较为常用的相似度评价软件。

5.6 评价方法的建立

复杂组分抗生素具有成分多样性的特点，发挥药效作用的物质并不局限于一种或少数几种成分，而是多种指标性成分药理作用的有机统一，所以单指标含量分析的质量控制模式已不满足现代多组分药物质量要求，多指标含量分析的质控模式逐渐被提出[18]。建立指纹图谱，运用相似度评价软件，对参比药物和测试药物的色谱图进行匹配并计算相似度，可以获悉药物的整体成分组成概貌，从宏观上反映质量的相似度。将指标组分定量分析与指纹图谱相似度评价相结合，从定性和定量两个角度反映药物化学组成信息，较之单一的测定更为全面准确。

5.7 该评价方法的意义

本研究建立了UPLC 指纹图谱相似度计算结合6 个指标性组分含量测定的方法，对多黏菌素E甲磺酸钠进口原研原料药和国产仿制原料药进行了质量一致性评价，该评价结果与仿制药生产企业的研究结果一致，彼此相互佐证。该方法全面可靠，不仅可以用于原料药之间的质量一致性考察，还可以用于制剂与原料药之间的质量差异分析，为复杂组分药物的质量评价提供了思路，具有一定的指导和推广意义。