CD55蛋白在肺癌中的表达及临床意义

金艳霞,张月洋,王 峥,黄安康,陈 颖,潘继承,王卫东,龚永生

(1.湖北师范大学生命科学学院 食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室特色野菜良种繁育与综合利用湖北省工程技术研究中心 生物学国家级实验教学示范中心,湖北 黄石 435002;2.苏州市相城区漕湖人民医院,江苏 苏州 215144;3.南京医科大学附属苏州医院,江苏 苏州 215008)

肺癌是起源于支气管粘膜上皮的原发性恶性肿瘤,据最新全球癌症数据显示肺癌在因癌症导致的死亡中占首位,比例高达20%[1].根据病理分类,约20%患者为小细胞癌(small cell lung cancer, SCLC),80%患者为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC);依据非小细胞肺癌组织亚型特点,又将其主要分为三类,即腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)、鳞癌(lung squamous cell carcinoma, LUSC)和大细胞癌(large cell carcinoma, LCC)[2]。目前临床上早期肺癌诊断的水平较低且发现晚、缺乏灵敏特异的早期诊断标志物,研究报道早诊早治可将NSCLC患者五年生存率提高到80%以上[3]。目前,常用的肺癌早筛方法是低剂量计算机断层扫描(low-dose computed tomography, LDCT),虽然将肺癌诊断率提高了20%,但其误诊率仍旧较高[4];肺癌常见的血清学早诊标志物有癌胚抗原、鳞状细胞癌抗原、细胞角蛋白片段19和神经元特异性烯醇化酶等,但它们对肺癌早期筛查敏感性较低[5]。目前研究较多的检测方法有液体活检,通常检测释放到血液中的循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、外泌体、microRNAs、外周血循环RNA、肿瘤诱导的血小板和循环肿瘤血管内皮细胞等[6],但液体活检缺乏标准化的检测方法,还需要更充分的技术支持。因此,仍需筛选高灵敏高特异性的肺癌早期诊断标志物。

肿瘤发生时,免疫系统会对体内产生的肿瘤抗原进行防御而产生“特异性免疫球蛋白”即肿瘤相关自身抗体(autoantibodies,AABs),是肿瘤的早期预警信号,在预防医学领域中发挥了积极作用[7]。例如,免疫检查点分子淋巴细胞激活基因 3 (lymphocyte activation gene 3, LAG-3),T 细胞免疫球蛋白及粘蛋白结构域 3 (T cell immunoglobulin domain and mucin domain 3, TIM-3)和 CD137 的联合检测有望提高NSCLC 的早期诊断准确性[8]。Ren等[9]采用酶联免疫吸附法检测7项自身抗体及肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1和NSE水平,发现联合检测能辅助NSCLC的早期诊断,在肺癌预防和早期筛查中发挥重要作用。在早期肺癌中与免疫相关的分子也发生了变化,Ye等[10]通过转录组测序从早期 NSCLC 的外周白细胞中筛选早期诊断标志物,发现酸性糖蛋白(alpha-acidglycoprotein, AGP)与转化生长因子 β(transforming growth factor-β, TGF-β)联合可能作为潜在的肿瘤标志物用于NSCLC的早期诊断。我们通过转录组数据挖掘发现,免疫分子CD59有可能作为肺癌生存判断的指标[11]。

前期利用RNA-Seq检测了早期 NSCLC 患者外周血中白细胞与健康受试者外周血白细胞中基因表达差异[11],由于中性粒细胞约占外周血白细胞数目的50%,本研究筛选了与中性粒细胞功能相关的CD55 糖蛋白,转录组数据显示CD55表达水平在肺癌患者外周血白细胞中显著下调,log2(肺癌组 FPKM/健康组 FPKM)值为-1.14 591[11]。本研究进一步利用 SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org)预测了CD55蛋白的空间结构;用GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn)分析CD55在肺癌中的表达情况;用蛋白印迹检测了肺癌患者血清样本中CD55的表达;并用SPSS软件(v26.0)进行ROC分析,探究CD55区分良恶肿瘤的效果、与临床常见肿瘤标志物、患者生化指标的相关性;用TISIDB数据库(http://cis.hku.hk/TISIDB/)分析CD55表达与肿瘤浸润性免疫细胞的相关性、与肺腺癌和肺鳞癌患者生存、分期和分型的相关性,判断CD55在肺癌中表达下降可能的原因;用Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/)分析CD55表达与肺癌患者生存的相关性;最后用STRING数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)分析与CD55互作的蛋白,旨在探究CD55作为肿瘤诊断和预后生存评价指标效果,为肺癌诊断和预后生存评价指标鉴定提供参考依据。

1 方法

1.1 样本采集

本研究符合南京医科大学伦理委员会制定的伦理学标准,受试对象完全基于自愿和知情同意原则,采集42例良性患者和48例NSCLC 患者的血液各2 mL以及临床电子病例检测指标,血液样本经离心分离得到血清。受试患者通过 LDCT 和组织病理学分析确诊,肺癌患者的分期判断依据国际肺癌研究协会(International Association for the Study of Lung Cancer, IASLC)的第八版 TNM 分期系统。

1.2 蛋白印迹

用蛋白印迹检测42例良性疾病患者和48例术前NSCLC患者的血清中CD55蛋白的表达水平,实验方法和数据分析参考已发表的文献[11]。CD55 抗体(Signalway Antibody,美国)按照1∶2 000稀释。显影条带用 Vilber FUSION FX7 化学发光成像仪拍照获得,用Image J 软件进行蛋白条带分析,用 GraphPad Prism 软件(v8.0)对蛋白条带定量数据进行统计分析。

1.3 SPSS软件统计分析

CD55表达与肺癌患者生化指标相关性采用SPSS软件进行分析,两组间统计采用独立样本参数型t检验分析,数据呈现平均值±标准偏差。CD55表达与患者临床检测指标之间相关性分析用双变量相关分析,pearson相关系数和双尾显著性检验。p<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 CD55的蛋白结构

CD55的编码序列来源于NCBI GeneBank (ID: 1604)和Uniprot 数据库(https://www.uniprot.org/uniprot/P13987),编码381个氨基酸,有一个N连接的GlcNAc修饰位点,C端有一个糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定位点[12],见图1A所示。SWISS-MODEL同源模建发现CD55蛋白的3D结构与pdb为3iyp.1.E的模板序列同源性为99.74%,主要由α 螺旋和 β 折叠组成。Uniprot 数据库也报道了 CD55 蛋白有 8 个二硫键,即位点 38与81、65与94、98与145、129与158、163与204、190与220、225与267和253与283 之间分别形成二硫键,3D结构和8个二硫键如图1B 所示。

图1 CD55的序列和3D结构A. CD55 基因序列。N-linked表示糖修饰位点,GPI-ancor amidated serine表示GPI锚定位点,下划线表示信号肽和前导肽;B. CD55 蛋白的 3D 结构,图中C代表半胱氨酸。

2.2 CD55在肺癌中的表达

运用 GEPIA 数据库分析发现,CD55 在LUSC组织中表达水平显著降低,在LUAD组织中表达水平无明显差异(图2A)。为了解血清水平CD55的表达情况,收集术前采样的42例良性患者血清样本和48例肺癌患者血清样本进行了验证,样本基本信息见表1.蛋白印迹实验结果表明CD55蛋白表达水平在良性样本和肺癌样本之间有显著差异,在肺癌血清样本中CD55表达显著下降(图2BC)。

图2 CD55在肺癌中的表达A. 运用GEPIA 数据库分析 CD55在肺腺癌和肺鳞癌组织中的mRNA表达水平。T,tumor,肿瘤组织;N,normal,正常组织;TPM,transcripts per million,每百万个转录本。B.检测肺癌患者血清中 CD55蛋白表达水平;C. 统计分析血清中CD55蛋白的表达情况。差异比较用非配对的t检验,**表示p值小于0.01.

癌症的发生与免疫微环境和免疫细胞密切相关,大多数肿瘤浸润性免疫细胞在肿瘤的发生发展中失衡[13]。因此推测CD55在肺癌中的异常表达可能与免疫相关。运用TISIDB数据库分析在LUAD和LUSC中CD55的表达与肿瘤浸润性免疫细胞的相关性,发现在LUAD中CD55表达水平与CD8+ T细胞呈负相关(r=-0.191,p=1.21×10-5),与NK细胞(r=-0.114,p=0.00 951)、巨噬细胞(r=-0.054,p=0.22)和中性粒细胞(r=0,p=0.092)无显著相关性(图3ABCD);在LUSC中CD55表达水平与NK细胞(r=0.235,p=1.18×10-7)、巨噬细胞(r=0.267,p=1.46×10-9)和中性粒细胞(r=0.371,p<2.2×10-16)呈显著正相关(图3EFGH)。然而,肺癌中CD55的表达水平与肿瘤浸润性免疫细胞之间的具体关系还需实验进一步验证。

图3 LUAD和LUSC中CD55表达与肿瘤浸润性免疫细胞的相关性ABCD.在LUAD中CD55表达与肿瘤浸润性免疫细胞的相关性,采用spearman相关系数进行相关分析。A,CD8+T细胞;B,NK细胞;C,巨噬细胞;D,中性粒细胞。EFGH. 在LUSC中CD55表达与肿瘤浸润性免疫细胞的相关性,采用spearman相关系数进行相关分析。E,CD8+T细胞;F,NK 细胞;G,巨噬细胞;H,中性粒细胞。

2.3 CD55表达与患者临床检测指标之间的关系

ROC曲线分析发现,相比其他临床肿瘤标志物,CD55可以有效区分良恶肿瘤,AUC值为0.744,灵敏度为80.0%,特异性76.9%(图4A和表2)。进一步分析CD55表达水平与患者肿瘤标志物的相关性发现,CD55表达与AFP、CA724和GP73显著相关(图4BCD,表2)。此外,通过双变量相关也分析了CD55表达与肺癌患者(n=48)临床生化指标之间的相关性,发现CD55表达水平与患者年龄、红细胞分布宽度标准差、凝血酶原时间、国际标准化比值和凝血酶时间显著相关(图5)。

表2 CD55表达与临床患者血清肿瘤标志物之间的相关性

图4 ROC曲线分析和CD55表达与肿瘤标志物的相关性分析A. ROC分析。BCD.运用SPSS软件进行双变量相关分析;p<0.05为有统计意义。AFP,alphafetoprotein,甲胎蛋白;CA724,carbohydrate antigen 724,糖类抗原724;GP73,Golgi protein 73,高尔基蛋白73.

图5 CD55表达与肺癌患者临床检测指标之间的相关性分析运用SPSS软件进行双变量相关分析, p<0.05为有统计意义。注:Age,年龄;RDWSD,red cell volume distribution width,红细胞分布宽度标准差;PT,prothrombin time,凝血酶原时间;INR,international normalized ratio,国际标准化比值;TT,thrombin time,凝血酶原时间。

2.4 CD55表达水平与肺癌患者生存的相关性分析

利用Kaplan-Meier Plotter 数据库分析CD55表达水平与肺癌患者生存的相关性,发现CD55 高表达的早期肺癌患者(n=298),其生存时间为136.33个月,CD55低表达的肺癌患者(n=279),其生存时间为62.3个月(图6A);在整个肺癌时期CD55高表达的患者(n=1 265),其生存时间为103个月,CD55低表达的患者(n=660),其生存时间为52.97个月(图6B),这一结果表明 CD55 有潜力作为肺癌患者预后生存的评价指标。进一步用TISIDB 分析CD55 mRNA表达水平在LUAD和LUSC中与肿瘤、生存、分期、免疫亚型与分子亚型之间的关系,发现CD55表达与LUAD和LUSC患者的生存和分期无显著相关性(图6CDEF);与LUAD和LUSC患者的免疫亚型有显著相关性(图6GH);与肺鳞癌患者的分子亚型也有显著相关性(图6I)。

图6 CD55 表达与肺癌患者生存、分期和分型之间的相关性A. 早期肺癌中CD55表达水平与肺癌患者生存的相关性分析;B. 在整个肺癌时期,CD55表达水平与肺癌患者生存的相关性分析;C.CD55表达与LUAD患者生存之间的相关性分析;D.CD55表达与LUSC患者生存之间的相关性分析;E. CD55表达与LUAD分期的关系;F. CD55表达与LUSC分期的关系;G.LUAD中CD55表达与免疫亚型之间的关系;H.LUSC中CD55表达与免疫亚型之间的关系;I.LUSC中CD55表达与分子亚型之间的关系。CPM,counts per million,每百万计数;C1,wound healing,创伤愈合;C2,IFN-gamma,γ-干扰素;C3,inflammatory,炎症;C4,lymphocyte depleted,淋巴细胞缺失;C5,immunologically quiet,免疫静息;C6,TGF-β,转化生长因子-β.

2.5 CD55蛋白与其它蛋白之间的相互作用

STRING 数据库分析与CD55可能有相互作用的蛋白,发现10 种蛋白与CD55 蛋白之间存在相互作用(图7),即膜攻击复合物抑制因子(membrane attack complex inhibitor, CD59)、粘附 G 蛋白偶联受体(adhesion G protein-coupled receptors, CD97)、补体C2、补体C3、补体C4α链(C4A)和补体C4β链(C4B)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM1)、A 类磷脂酰肌醇聚糖(phosphatidylinositol glycan class A, PIGA)、粘附 G 蛋白偶联受体 E2(adhesion G protein-coupled receptor E2, EMR2)。

图7 分析与CD55蛋白相互作用的蛋白(在STRING数据中选择物种:人)

3 讨论

CD55是一种糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidy linositol, GPI)锚定的V型跨膜蛋白,由于存在不同的糖基化形式,其分子量分布在55 kDa到75 kDa不等,是膜结合性补体调节蛋白(membrane-bound complement regulatory proteins, mCPRs)的重要成员,在血液和多种组织中表达[14]。CD55可防止细胞发生补体介导的细胞毒性[15],其能增强补体激活,发生级联酶促反应[16],增加中性粒细胞、单核细胞和 T 细胞的募集[17]。CD55主要功能是通过解离 C3 和 C5 转化酶来抑制补体介导的裂解,其在肿瘤细胞上的过表达可以起到保护作用,避免肿瘤细胞被补体裂解;还可以阻止抗原呈递细胞对肿瘤细胞的吞噬[18]。有研究也发现在 NSCLC 组织中CD55 的转录水平下调,并通过唾液酸化加工成其它生物大分子,这使得其成为 NSCLC 的潜在标志物[19]。

本研究基于前期转录组数据鉴定发现的CD55在肺癌外周血白细胞中表达下调[11],运用COSMIC数据库分析了CD55在肺癌中的突变情况,发现0.58%的病例表现出点突变,1.6%的病例表现出拷贝数变异(数据来源:https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic),基因突变也许是CD55在肺癌中异常表达的原因之一。生物信息学数据库分析和实验验证发现,相比健康样本,CD55在肺鳞癌组织中下降,在肺腺癌组织中表达水平无显著差异。蛋白印迹实验结果表明 CD55 在NSCLC 患者血清中蛋白表达水平相比良性患者血清样本显著下降;TISIDB数据库分析发现CD55的表达在肺腺癌和肺鳞癌中与浸润的相关免疫细胞不同,CD55在肺腺癌中表达水平与肿瘤浸润性CD8+ T细胞呈负相关,与NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞无显著相关性;在肺鳞癌中其表达与NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞均呈显著正相关(图3),可能其表达水平也受到免疫细胞不同程度的调控。研究报道CD55蛋白在鳞癌和腺癌中的表达不同的原因可能是腺癌细胞抑制补体介导的细胞损伤的水平表达导致其在组织中表达下降的趋势不如鳞癌[20]。

良恶肿瘤的区分一直是肺癌诊断的难题,本研究发现CD55区分肺部良恶肿瘤效果比现有临床肿瘤标志物更好,而且CD55表达水平与肿瘤标志物AFP、CA724和GP73显著相关(图4)。Zhang等[21]研究表明GP73在肺癌患者的血清中高表达;韩等[22]通过统计分析表明GP73可以作为肺腺癌和鳞癌鉴别诊断的标志物。而且,CD55表达与肺癌患者临床生化指标中凝血因子具有显著相关性(图5)。大量证据表明肺癌与高凝状态有关,癌细胞可表达促凝血因子,激活凝血级联反应;分泌肿瘤坏死因子α等可溶性介质或与宿主血管和血细胞直接接触,刺激促凝血因子的表达[23]。补体蛋白过度激活也可加强高炎症和高凝途径,并导致组织损伤和器官衰竭[24]。因此,本研究为CD55可能作为潜在的肺癌诊断标志物提供了依据,也为CD55参与肺癌发生机制探究提供了参考。

本研究分析发现CD55表达与肺癌生存相关,低表达CD55的肺癌患者生存期更短,推测是因为 CD55 抑制自然杀伤(natural killer cells, NK cells) 细胞的细胞毒性,CD55 高表达有利于 NK 细胞的激活,当其低表达时,NK 细胞功能失衡不能及时发生效应,可能引起肿瘤细胞发生免疫逃逸,导致肿瘤恶性发展,患者的生存时间更短[12]。实验还发现CD55表达与LUAD和LUSC患者的免疫亚型有显著相关性,与肺鳞癌的分子亚型也有显著相关性(图 6)。

STRING分析发现与CD55相互作用的蛋白大多参与免疫调控,如补体CD59蛋白。Li等[25]发现NSCLC中CD59 表达增加导致 caspase-3 和 Fas 表达减少、Bcl-2 表达增加,从而影响肺癌的发生发展。CD97 是 G 蛋白偶联受体家族的成员,通过与其配体 CD55 相互作用在血管生成、肿瘤分化中发挥作用[26],且在肿瘤发生发展中可刺激影响肿瘤侵袭性并表现出粘附特性[27]。EMR2在单核细胞/巨噬细胞高度表达,并与中性粒细胞迁移和活化有关,可促进粒细胞趋化、脱粒和粘附,在巨噬细胞中能促进炎性细胞因子的释放[28]。炎症因子ICAM1对于中性粒细胞粘附和跨内皮迁移至关重要[29]。CD55作为补体激活调节因子中的一员,针对免疫分子的肿瘤靶向治疗也备受关注,Dho等[30]开发了一种新型嵌合抗 CD55 特异性单克隆抗体并证明了其在胸膜转移性肺癌中具有抗肿瘤功效。Zhang等[31]构建了一种携带两个治疗基因的溶瘤腺病毒CD55-TRAIL-IETD-MnSOD可以有效抑制肺癌生长,是潜在的肺癌治疗方法。这些研究表明CD55可能参与肺癌的发生,有望作为肺癌治疗的靶点。

综上所述,本研究检测了CD55在肺癌中的表达,以及区分良恶肿瘤的效果,探究了CD55表达水平与患者肿瘤标志物和生化指标的相关性、与肺癌分期、分型、患者生存的相关性,表明CD55 有潜力作为肺癌诊断和预后生存的肿瘤标志物。