银翘解毒片高效液相色谱指纹图谱研究*

吴 琦，贾银芝，2，刘益庆△，陈 红

（1. 连云港市食品药品检验检测中心，江苏 连云港 222006；2. 江苏省食品药品监督检验研究院连云港检验室，江苏 连云港 222006）

银翘解毒片源自清代吴鞠通《温病条辨》中的银翘散［1］，由金银花、连翘、薄荷、荆芥、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、淡竹叶、甘草9 味中药材组方，有疏风解表、清热解毒功效，主要用于治疗风热感冒，症见发热头痛、咳嗽口干、咽喉疼痛。2020 年版《中国药典（一部）》以绿原酸和连翘苷为含量测定指标控制其质量［2］。目前对银翘解毒片质量控制的研究，主要是利用高效液相色谱（HPLC）法测定绿原酸［3-4］、连翘苷［5］、连翘酯苷A［3，6-7］、牛蒡苷［3，5］、木犀草苷［3］、甘草酸［8］等的含量，也有研究采用毛细管电泳［9］（CE）法和HPLC［10-11］串联紫外检测器（UV）或二极管阵列检测器（PDA）法建立银翘解毒片的指纹图谱。中药指纹图谱能整体反映中药材或中药制剂所含化学成分的种类和数量，因此，研究指纹图谱对于制剂的质量控制十分必要。但UV 具有一定局限性，如处方中桔梗的主要成分桔梗皂苷D 不能被其检出，故需要一种通用型检测器作为补充。本研究中采用HPLC 与PDA 或蒸发光散射检测器（HPLC - ELSD）联合（HPLC - PDA 或HPLC - ELSD）技术建立了银翘解毒片的指纹图谱，为制剂的质量控制提供了新的方法和策略。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

E2695 型高效液相色谱仪、包括2998 型PDA 检测器、2424 型ELSD 检测器（美国Waters 公司）；BP211D 型电子天平（德国Sartorius 公司，精度为0.01 mg）；AE -100型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为0.1 mg）；IQ 7000 型纯水机（美国Milli-Q 公司）；F-100SD 型超声波清洗器（深圳福洋科技集团有限公司）。

1.2 试药

银翘解毒片（15批，11家企业生产，样品信息见表1）；绿原酸（批号为110753-202018，含量96.1%），甘草苷（批号为111610-201908，含量95.0%），连翘酯苷A（批号为111810-202108，含量96.2%），木犀草苷（批号为111720-202111，含量96.6%），橙皮苷（批号为110721-202019，含量95.3%），连翘苷（批号为110821- 202117，含量94.9%），牛蒡苷（批号为110819 - 201812，含量95.0%），桔梗皂苷D（批号为111851 - 201708，含量97.9%），甘草酸铵（批号为110731 - 202122，含量94.4%）对照品，均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

表1 15批样品信息Tab.1 Information of 15 batches of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈（A）- 水（B），梯度洗脱（0～5 min时8%A，5～25 min时8%A →17%A，25～34 min时17%A →18%A，34～57 min 时18%A →30%A，57～65 min 时30%A →38%A，65～72 min 时38%A，72～74 min时38%A →100%A）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10µL；PDA 检测波长：230 nm；ELSD条件：漂移管温度为75 ℃，气体压力为25 psi。

2.2 溶液制备

取绿原酸、甘草苷、连翘酯苷A、木犀草苷、橙皮苷、连翘苷、牛蒡苷、桔梗皂苷D、甘草酸铵的对照品各约10 mg，精密称定，分别置20 mL容量瓶中，加甲醇15 mL，超声（功率600 W，频率40 kHz，下同）处理30 min，放冷至室温，用甲醇定容，摇匀，即得单一对照品溶液。

取样品10 片，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷至室温，再次称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验：取样品（编号S7）适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定6次，以32 号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果HPLC - ELSD 图谱各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.29%（n=6），相对峰面积的RSD均小于2.21%（n=6）；HPLC-PDA 图谱各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.38%（n= 6），相对峰面积的RSD均小于2.37%（n=6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取样品（编号S7）适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，2，4，8，12，24 h时按2.1 项下色谱条件进样测定，以32 号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，HPLC-ELSD图谱各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.31%（n=6），相对峰面积的RSD均小于2.34%（n=6）；HPLC - PDA 图谱各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.44%（n= 6），相对峰面积的RSD均小于2.59%（n=6），表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取样品（编号S7）适量，按2.2 项下方法平行制备供试品溶液6 份，再按2.1 项下色谱条件进样测定，以32号峰为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，HPLC-ELSD图谱各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.56%（n= 6），相对峰面积的RSD均小于2.52%（n=6）；HPLC-PDA 图谱各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.64%（n= 6），相对峰面积的RSD均小于2.75%（n=6），表明方法重复性良好。

2.4 指纹图谱建立

HPLC - PDA 指纹图谱的建立：取15 批样品适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，将各批样品色谱峰分别进行积分，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版），以编号S7 样品的色谱图作为参照图谱，剪切溶剂峰，选择中位数法，时间窗设为0.2 min，采用多点校正法建立叠加指纹图谱（见图1），生成对照指纹图谱（见图2），根据匹配结果共标定35 个共有峰。各共有峰保留时间的RSD为0.03%～0.68%，峰面积的RSD为19.62%～87.12%，表明共有峰的出峰时间较稳定，但不同批次样品成分含量波动较大。15 批样品与对照图谱的相似度结果见表2。仅1 批样品（S13）的相似度小于0.9，表明不同厂家不同批次银翘解毒片的相似性较好。

图1 15批银翘解毒片的高效液相色谱-二极管阵列检测器叠加指纹图谱Fig.1 HPLC - PDA superimposed fingerprint of 15 batches of Yinqiao Jiedu Tablets

图2 银翘解毒片的高效液相色谱-二极管阵列检测器对照指纹图谱Fig.2 HPLC - PDA reference fingerprint of Yinqiao Jiedu Tablets

表2 15批银翘解毒片样品的相似度Tab.2 Similarity of 15 batches of Yinqiao Jiedu Tablets

HPLC - ELSD 指纹图谱的建立：按上述方法建立HPLC-ELSD 叠加指纹图谱（见图3），生成对照指纹图谱（见图4）。共标定26 个共有峰，其中除36 号峰外均可与HPLC - PDA 指纹图谱中的共有峰对应。15 批样品中，各共有峰保留时间的RSD为0.04%～0.37%，峰面积的RSD为38.30%～88.81%，表明共有峰的出峰时间较稳定，但不同批次样品的成分含量波动较大。15 批样品与对照图谱的相似度结果见表2。仅2 批（S9 及S13）样品的相似度小于0.9，表明不同厂家不同批次银翘解毒片的相似性较好。

图4 银翘解毒片的高效液相色谱-蒸发光散射检测器对照指纹图谱Fig.4 HPLC - ELSD reference fingerprint of Yinqiao Jiedu Tablets

2.5 共有峰的定性分析

取2.2项下单一对照品溶液及供试品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，比对指认色谱峰。HPLCPDA 色谱图中鉴定出9 号峰为绿原酸，17 号峰为甘草苷，20 号峰为连翘酯苷A，21 号峰为木犀草苷，26 号峰为橙皮苷，30 号峰为连翘苷，32 号峰为牛蒡苷，35 号峰为甘草酸铵，详见图5。HPLC - ELSD 色谱图中鉴定出36号峰为桔梗皂苷D，详见图6。

图5 高效液相色谱-二极管阵列检测器色谱图9.Chlorogenic acid 17.Liquiritin 20.Forsythoside A 21.Luteoloside 26.Hesperidin 30.Phillyrin 32.Arctiin 35.Glycyrrhizic acid ammonium saltA.Test solution B.Chlorogenic acid reference solution C.Liquiritin reference solution D.Forsythoside A reference solution E.Luteoloside reference solution F.Hesperidin reference solution G.Phillyrin reference solution H.Arctiin reference solution I.Glycyrrhizic acid ammonium salt reference solutionFig.5 HPLC - PAD chromatograms

图6 高效液相色谱-蒸发光散射检测器色谱图36.Platycodin DA.Test solution B.Reference solution of platycodin DFig.6 HPLC - ELSD chromatograms

3 讨论

3.1 试验条件选择

预试验中分别考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水3种流动相，结果显示，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱时，各成分分离效果较好。分别考察了温度（30，35，40 ℃）和流速（0.8，1.0，1.2 mL / min）对色谱峰分离效果的影响，结果显示，柱温为30 ℃、流速为1.0 mL/min 时能使基线平稳，且分离度和峰形达到较好效果。同时采用PDA 进行紫外全波长扫描，兼顾各成分的检测信号强度和检测灵敏度，在230 nm 波长处色谱图基线噪音较低，峰数目多，分离度较好，且基线稳定，故选择230 nm 为检测波长。对ELSD 漂移管温度（70，75，80 ℃）和气体压力（20，25，30 psi）进行考察，最终确定漂移管温度75 ℃、气体压力25 psi 为最优ELSD参数。

3.2 检测器选择

PDA 适用于有紫外吸收的化学成分，对于无紫外吸收的成分检测具有一定局限性。ELSD 是通用型检测器，不依赖被测成分的光学特性，可检测无紫外吸收或紫外吸收较弱的成分。银翘解毒片处方中桔梗的指标成分桔梗皂苷D 紫外吸收较弱，HPLC - ELSD 法较HPLC-UV法更适于桔梗皂苷D的含量测定［12］。2005年版《中国药典（一部）》把2000年版及以前版本中列出的金银花分列为金银花和山银花，在药典收载变化后，部分厂家申请将处方中的金银花变更为山银花，但处方中含金银花的制剂仍存在用山银花投料现象［13-16］。山银花含有金银花所没有的特征成分灰毡毛忍冬皂苷乙，该成分紫外吸收较弱，药典规定山银花中灰毡毛忍冬皂苷乙的测定采用HPLC-ELSD 法，故将PDA 和ELSD合用，建立更全面的指纹图谱的同时也对金银花投料的规范性进行有效控制。

3.3 指纹图谱分析

本研究中建立了银翘解毒片的HPLC - PDA 和HPLC-ELSD 指纹图谱，在PDA 和ELSD 下分别标定了35 个和26 个共有峰，通过对照品比对法指认了9 个共有峰。指纹图谱相似度结果表明，11个厂家的15批银翘解毒片样品的相似性较好，但成分的含量存在显著差异，说明生产所用药材质量参差不齐，或者生产工艺转移率不一致。

3.4 方法评价

本研究中所建立的HPLC-PDA-ELSD指纹图谱，相较单一检测法能更全面地反映制剂的指纹图谱特征，该研究为银翘解毒片的质量控制提供了一定参考。