草地贪夜蛾病原白僵菌的分离鉴定及其致病力研究

邹春华 刘继辉 吴伟 徐勋志 谢秀菊

关键词：草地贪夜蛾；球孢白僵茵；分离鉴定；致病力

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda （J.E．Smith），又名秋黏虫（fall armyworm），隶属于鳞翅目Lepidoptera，夜蛾科Noctuidae，是一种原产于美洲热带和亚热带地区的杂食性害虫。因其寄主范围宽，适生区域广，增殖潜能强，扩散速度快，突发为害重等特点，自2019年1月入侵我国云南省普洱市江城县以来，已快速扩散至27省（区、市），2020年全年发生面积达134.6万hm2，已成为我国农业生产上的一种新的常发性重大害虫。入侵我国的草地贪夜蛾现已确认为“玉米型”，其在幼虫期（1～6龄）均可取食为害，为害部位主要包括玉米的生长点、叶片、雄穗和果穗等，严重影响玉米的产量和品质。华南地区处于亚热带气候，可周年种植玉米，为草地贪夜蛾周年繁殖提供了良好的条件，防控压力巨大。

现阶段，我国草地贪夜蛾防治仍以化学药剂为主。农业农村部在2019年6月推荐的25种应急防治药剂中，化学杀虫剂有19种，比例达76%。但施用化学药剂会产生抗药性和环境污染问题，而生物防治在生态环保、对人畜无害等方面的优势，是草地贪夜蛾防治的重要有益补充。目前，生物防治研究主要集中在捕食性天敌、寄生性天敌、昆虫核型多角体病毒和昆虫病原真菌等方面。其中，筛选对草地贪夜蛾特异性高和防治效果好的昆虫病原真菌，是草地贪夜蛾可持续防控工作的重要任务。国内外已报道绿僵菌Metarhiziurn spp．和白僵菌Beau--oeria spp.等对草地贪夜蛾的低龄幼虫具有杀虫活性，而在非洲已有白僵菌产品登记用于防治草地贪夜蛾低龄幼虫。然而，昆虫病原真菌不同菌株对草地贪夜蛾的侵染致病作用不同，且在田间自然感染草地贪夜蛾的昆虫病原真菌还不多见。在国内，郑亚强等和雷妍圆等分别从云南曲靖和广东广州玉米田发现并分离鉴定了感染草地贪夜蛾幼虫的莱氏绿僵菌Metarhiziurn rileyi，程东美等和庞继鑫等分别在广东广州和云南大理玉米田发现草地贪夜蛾僵虫并分离获得了球孢白僵菌Beauverza bassiana，因此，开展昆虫病原真菌资源收集及生防功能评价十分必要。

本研究从玉米植株上采集到自然罹病的草地贪夜蛾僵虫，分离得到一株菌株，通过形态学与核糖体DNA ITS序列分析，对该病原真菌进行了鉴定，并测定了其对草地贪夜蛾2龄幼虫的致病活性，旨在为草地贪夜蛾生物防治提供菌种资源，同时也可为该菌株的生防潜力研究奠定基础。

1材料与方法

1.1虫生真菌分离培养

自广东省广州市南沙区某地块（22°42＇51＂N，113°34＇19＂E）玉米植株上采集到自然罹病的草地贪夜蛾幼虫僵虫，将其在75%的乙醇中浸泡5s，之后用无菌水冲洗3次，最后将处理好的僵虫等分成3小段，呈等边三角形放入含有PDA培养基的培养皿中，置于（25±1）℃、光周期L∥D=14h∥10h、光照强度3000lx的RQX-01型人工气候箱中培养6d后，挑取菌落上少量孢子至新的培養基进行纯化培养，得到纯菌株。

1.2菌落形态学观察

将纯菌株接种培养，观察并记录其菌落生长情况及形态特征。采用光学显微镜（OLYMPUSCX31RTSF）及其配套的TUCSEN显微成像系统观察菌落菌丝形态、产孢结构和分生孢子形态等，并拍照记录，根据菌株形态进行分类鉴定。

1.3菌株rDNA-ITS序列分析

用真菌基因组DNA提取试剂盒（广州鼎国生物技术有限公司提供）获得菌株总DNA。采用真菌通用引物进行菌株rDNA-ITS序列PCR扩增。PCR反应体系50uL： I-52×High-Fidelity Master Mix 25uL，DNA模板1uL，上、下游引物各2uL（10umol/L），ddH20 20uL。扩增程序：94℃预变性5 min; 94℃30s，56℃ 30s，72℃ 90s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至广州锐捷生物科技有限公司测序。将得到的DNA片段序列在NCBI数据库中进行比对，确定该菌株的种属关系。

1.4菌株致病活性测定

1.4.1孢子悬浮液的制备

菌株培养产孢后，用无菌刀片刮取菌落表面分生孢子到0.1%吐温-80无菌水溶液的三角瓶中，在磁力搅拌器上充分搅拌使孢子均匀分散在溶液中，用血球计数板测定孢子浓度，并将孢子悬浮液调配成所需要的浓度。

1.4.2试虫感病观察

采集用玉米植株饲养于养虫棚内的活跃健康且大小基本一致的草地贪夜蛾2龄幼虫，用于回接感病观察。将幼虫用1.00×108个/mL的孢子悬浮液浸泡15s后放在干净的滤纸上自然晾干，再置于培养盒中，每天用新鲜玉米叶和果穗，于（25±1）℃、光周期L∥D=12h∥12h、光照强度3000lx的RQX-O1型人工气候箱中饲养，观察虫体的感染情况。测试20头幼虫。

1.4.3菌株致病活性试验

用无菌蒸馏水制备5个浓度的孢子悬浮液，浓度分别为1.00×109、1.00×108、1.00×107、1.00×106、1.00×105个/mL。用浸虫法接种草地贪夜蛾2龄幼虫，以无菌蒸馏水处理为对照，共计6个处理。每个处理3次重复，每次重复30头2龄幼虫，饲养方法同1.4.2。接种后从第2天开始，每天定时观察，记录幼虫死亡数，连续观察14d，对死亡幼虫进行保湿观察，虫体表面长出白色菌丝或白色分生孢子的视为染菌致死。

1.5数据处理

使用SPSS 22.0进行处理分析，采用Probit方法求回归方程及计算致死中浓度（LCso）和致死中时（LT50）。采用Tukey法对不同处理的累计死亡率进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1菌株形态特征

田间罹病的草地贪夜蛾幼虫僵虫发现于玉米穗顶端，罹病虫体呈白色（图1a）。分离纯化获得病原真菌，编号为SfG01。将菌株SfG01接种于PDA培养基上，菌落呈白色，不规则圆形，中央微隆起，产孢后，表面呈浅灰色，培养7d菌落直径2.6cm（图1b），菌落背面呈淡黄色（图1c）。分生孢子梗直立，着生于营养菌丝顶端或其分枝上，分生孢子近球形或卵圆形，无色透明，大小为（2.0～5.8）um×（1.9～6．0）um（图1d）。

2.2菌株rDNA-ITS序列分析

SfGO1菌株rDNA-ITS的PCR扩增产物片段经测定，序列共509 bp。将该段序列提交GenBank数据库中进行BLAST比对，选取相关序列，并使用MEGA 11.0将相关序列下载，以Cordycep.s ningxi-aensis HMJAU 25074为外群，采用Neighbor-joining法构建系统发育进化树（图2）。比对结果显示，分离的菌株与球孢白僵菌菌株（登录号NR_111594.1）属于同一进化分支，相似度高达99.20%。因此，综合形态学分析和rDNA-ITS序列相似性分析，将该菌株确定为球孢白僵菌。

2.3幼虫感病症状

草地贪夜蛾2龄幼虫接种1.00×108个/mL的SfG01菌株孢子悬浮液后，第2～3天，虫体活动正常，第4天开始变得不活跃，并且拒食；第5天出现死亡，并且虫体表面颜色变黑和浅黄（图3a）；第7天虫体头部和背部开始长出白色菌丝（图3b）；第10天长出大量菌丝，并伴随产生少量孢子，随后孢子继续增多（图3c）；第14天虫体表面已布满菌丝和孢子（图3d）。说明该菌株是草地贪夜蛾的致病菌。

2.4不同浓度SfG01孢子悬浮液对草地贪夜蛾的致病活性

随着球孢白僵菌菌株SfG01孢子浓度的增加和处理时间的延长，草地贪夜蛾2龄幼虫的累计死亡率不断提高，接种后lld，浓度为1.00×109、1.00×108个/mL和1.00×107个/mL处理下幼虫的累计死亡率均达最高值，其中以最高浓度（1.00×109个/mL）处理后幼虫的累计死亡率最高，达86.67%（图4）。

球孢白僵菌菌株SfGOI对草地贪夜蛾2齡幼虫的致病活性存在时间一剂量效应，随孢子悬浮液浓度的增加，LT50缩短；当浓度由1.00×108升至1.00×109个/mL时，幼虫LTso从7.75 d降至6.50 d，而当孢子浓度为1.00×107、1.00×106个/mL和1.00×105个/mL时，幼虫累计死亡率均低于50.00%，无法计算LT50值（表1）。

应用Probit模型，得到菌株SfGOI对草地贪夜蛾2龄第11天的致病活性回归方程PROBIT=-4.318+0.497x，第11天时的LC50为4.85×107个/mL，95%置信区间为1.39×107～8.42×107个/mL。

3结论与讨论

国内外关于虫生真菌防治害虫的研究很多，其中，最主要的包括白僵菌、绿僵菌等病原真菌。昆虫病原真菌要应用于农业害虫防治，获得优良的菌株是重要前提。本研究从自然染病的草地贪夜蛾幼虫僵虫上分离纯化得到1株昆虫病原真菌，用其不同浓度的孢子悬浮液侵染草地贪夜蛾2龄幼虫，高浓度（1.00×109个/mL）侵染时致死中时（LTso）为6.50d，致死率高达86.67%，第11天时的LC50为4.85×107个/mL，表现出较强的致病活性，具有潜在的应用价值。在实际运用中，单独使用杀虫真菌制剂进行防治，难以在短时间内达到防控目的，应进一步研究其与化学农药的复配使用，以期达到速效减量增效的效果，为草地贪夜蛾的安全、持效控制提供支撑。

试验过程中发现SfG01菌株分生孢子悬浮液处理可以延缓草地贪夜蛾幼虫的发育，引起草地贪夜蛾蛹的黑化并影响其羽化，这与彭国雄等关于球孢白僵菌（菌株编号ZJU435）和金龟子绿僵菌（菌株编号CQMa421）对草地贪夜蛾、马涛等关于白僵菌对灰茶尺蠖Ectropis grisescens的研究结果相似。此外，庞继鑫等发现球孢白僵菌（菌株编号SHL-2020）对草地贪夜蛾雌、雄成虫均具有较强的侵染致病作用，因此，进一步研究球孢白僵菌SfG01菌株对草地贪夜蛾生长发育及求偶、交配和产卵等行为的影响，进而探究其对草地贪夜蛾种群的控制力，对将来在实际中进行应用意义重大。