郁金香和百合主要病害、病原及鉴定方法

廖天蓝 罗金燕 陈磊 朱洁 李斌 安千里

关键词：郁金香；百合；球根花卉；病害；病原鉴定

球根花卉（bulb flowers）因其花色丰富、花形硕大、成品花价格高等特点，成为花卉产业中重要的生产种类，在国内花卉市场上所占份额也日渐增多。常见栽培的球根花卉涉及20余科，上千个品种，其中百合科Liliaceae多年生草本鳞茎类植物郁金香和百合最为常见。郁金香花色丰富，植株刚劲挺拔，叶色素雅秀丽，有相当高的观赏价值，在世界各地广泛应用于鲜切花生产、庭院栽培以及盆栽。在全球范围内，郁金香种植总面积达1.3万hm2，荷兰是世界上最大的郁金香栽培国，占全球种植面积的88%，种球产量超过43亿颗。百合花除了具有观赏性，又因含有芳香油，可从中提取香精炼制香料，而百合鳞茎可供食用或药用，药食兼优。在我国，食用百合主要产地有甘肃兰州、湖南隆回、江苏宜兴等，种植面积超2万hm2；观赏百合主要产地有云南昆明、辽宁凌源、广东佛山等，种植面积约8000hm2。

郁金香和百合是较易感病的花卉，在实际生产过程中，经常发生由真菌、细菌和病毒等引起的病害，不仅影响郁金香和百合的正常生长，导致产量和观赏性下降，病害严重时甚至对郁金香和百合产业产生毁灭性打击，造成巨大经济损失。因此，在普查国内郁金香和百合主要病害和病原的基础上，总结有效的病害病原检测检疫方法，可为建立郁金香和百合主要病害防治体系奠定基础，为郁金香和百合产业的规模化发展提供支撑。

1郁金香主要病害、病原及检测方法

1.1郁金香主要真菌病害和病原真菌

郁金香的真菌病害主要有郁金香种球腐烂病、郁金香枯萎病、郁金香青霉病和郁金香灰霉病（表1）。

1.1.1郁金香种球腐烂病

郁金香种球腐烂病引起的种球腐烂多从鳞茎开始，由外向内逐渐扩大，病健交界处呈褐色水渍状病斑，鳞茎中央部分坏死，病斑干燥后，呈黄褐色于腐。早在1965年就有报道，尖孢镰刀菌郁金香专化型导致郁金香种球腐烂病，国内已发现尖孢镰刀菌郁金香专化型和串珠镰刀菌F．rnoniLiforrn.e引起郁金香种球腐烂病。

1.1.2郁金香枯萎病

郁金香枯萎病一般发生在郁金香种球的贮藏期，发病初期郁金香鳞茎鳞片上出现紫红色的小斑点，之后扩展成不规则黄色至浅褐色病斑，发病后期郁金香种球呈现褐色干枯状。鳞茎未被感染的郁金香植株染病后，叶片和花梗上的病斑浅灰色，边缘褐色，病斑逐渐扩大集结，最后茎叶完全枯萎。病原菌为层出镰刀菌F．proliferatum。

1.1.3郁金香青霉病

郁金香青霉病主要危害鳞茎。受害鳞茎表面形成暗褐色凹陷病斑，鳞茎内部鳞片逐渐腐烂，最后整个鳞茎干朽萎缩，且表面出现蓝绿色霉层，病株的地上部也可表现出症状。病原菌是圆弧青霉和丛花青霉。

1.1.4郁金香灰霉病

郁金香灰霉病危害叶片、花朵和鳞茎。叶片受害后多向一侧卷皱，病斑覆盖灰色霉层；花朵受害后产生褐色病斑，病斑覆盖灰色霉层，后期花朵干枯；鳞茎受害后，外皮褐色碎裂，上面有许多黑色小菌核，由受害鳞茎长出的植株矮化。病原菌为郁金香葡萄孢Botrytis tulipae。

1.2郁金香主要细菌病害和病原细菌

郁金香的细菌病害主要有郁金香溃疡病和郁金香软腐病。

1.2.1郁金香溃疡病

郁金香溃疡病最早于1964年在荷兰发现，病原菌为萎蔫短小杆菌奥氏致病变种CurtobacteriurnfZaccumfaciens pv. oortii，又稱郁金香黄色疱斑病菌。感病郁金香花朵萎蔫变形，叶片失水褪绿，10～15d内全株发病，整株干枯死亡。1983年我国首次报道在台湾省发生郁金香溃疡病，1986年从日本引种郁金香到浙江省时传人中国大陆。邵秀玲等针对郁金香黄色疱斑病菌的16S-23S rRNA基因间隔区序列，设计了一对特异性引物和TaqMan探针，建立了实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chainreaction，qPCR）方法特异性检测，用于郁金香溃疡病疑似或初期症状的快速诊断。

1.2.2郁金香软腐病

郁金香软腐病危害郁金香鳞茎，使其变褐、变软、腐烂并发出臭味。任国兰等首次对郁金香软腐病的病原菌进行了分离鉴定，发现该病原菌与引起大白菜软腐病的病原细菌的特性完全相同，能侵染大白菜、马铃薯、辣椒和洋葱，因此，鉴定该病原菌为胡萝卜欧文氏菌胡萝卜亚种，该病菌后来被确定为胡萝卜果胶杆菌。菊迪基氏菌（旧称菊欧文氏菌）和洋葱腐烂病菌（唐菖蒲伯克霍尔德氏菌葱生致病变种BurkhoLderia gladioli pv.allicola）也能引起郁金香软腐病。

1.3郁金香病毒病和主要病毒

郁金香病毒病使郁金香种球产量与品质严重下降，制约着郁金香栽培及鲜切花生产的发展，主要病原是郁金香碎色病毒（tulip breaking virus，TBV）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）和烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV），均是RNA病毒。张西英等针对TBV和CMV的外壳蛋白编码序列设计特异引物，将逆转录酶与DNA聚合酶混合，实现在同一反应体系中连续进行逆转录聚合酶链式反应（reverse-transcription polymerasechain reaction，RT-PCR）和PCR，检测病毒感染情况。

郁金香碎色病毒病是现代郁金香栽培中最重要的病毒病，感病花朵上出现不规则的火焰和羽毛状图案。Agoston等采集了32个具有典型郁金香碎色病毒病的郁金香病株的叶片，通过酶联免疫吸附试验（enzyme

linked

immunosorbent

assay，ELISA）和RT-PCR检测鉴定出了3种马铃薯Y病毒属病毒：TBV、百合斑驳病毒（lily mottle virus，LMoV）和伦勃朗郁金香碎色病毒（Rembrandt tu-lip-breaking virus，ReTBV）。叶蓉春等基于TBV的核酸序列设计特异引物组合，筛选出10对引物，用RT-PCR能够从感郁金香碎色病毒病植株中扩增出特异性条带，而正常植株为阴性，可用于检测TBV。结合生物接种试验和特征症状也可以鉴定TBV。Polder等使用机器学习算法开发了一个基于机器视觉的自动系统，通过使用感染TBV的郁金香图像训练卷积神经网络（convolutional

neu-ral networks），自动化检测田间感染TBV的郁金香植株。

TRV主要通过毛刺属Trichodorus和拟毛刺属Paratrichodorus的线虫进行传播，寄主广泛，能感染多种球根花卉，如郁金香、百合和水仙等，感病植株叶片呈现斑驳症状。针对TRV的免疫学方法和核酸扩增方法，如ELISA、RT-PCR、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）已广泛用于TRV的检测中。

1.4郁金香线虫病和主要病原线虫

1999年珠海市海滨公园种植的荷兰进口郁金香发生线虫病。鳞茎外鳞片出现大小不等的褐色病斑，线虫集中在鳞茎长根处，使鳞茎少根甚至无根；植株矮小，叶片低垂或卷曲，叶片变黄甚至枯死。感病品种‘白梦’近70%植株枯死不抽花；有花的，花小且暗淡，观赏价值大减。病原有滑刃属Aphelen-choides和茎属Ditylenchus线虫。发病原因很可能是荷兰进口的郁金香种球携带线虫。由荷兰进口郁金香种球在锦州世博园种植，有些郁金香植株有明显的萎蔫、矮化和黄化症状，从球茎中分离鉴定到滑刃线虫。全国各地口岸多次从进境郁金香种球中截获滑刃线虫、茎线虫和短体线虫Pratylen-chus。茎线虫主要分布于温带地区，寄主范围广，为害多种作物蔬菜和郁金香、风信子、水仙等球根类观赏植物，其取食植物地下和地上部，随寄主植物的种子、鳞球茎、匍匐茎、植物残体和土壤传播。短体线虫也称根腐线虫，是迁徙性内寄生线虫，全球分布，寄主植物广泛，是危害仅次于根结线虫和孢囊线虫的重要植物寄生线虫。短体线虫能造成严重的根部损伤，伤口引发真菌和细菌的二次侵染，导致整个根系腐烂。

毛刺属和拟毛刺属线虫是外寄生线虫，寄主广泛，包括作物、果树、观赏植物等，通过种子、块茎、带根苗木和土壤传播，不仅直接取食为害寄主植物，造成球根花卉根系腐烂、植株死亡，还能作为介体将TRV传播给郁金香和百合等多种植物。

2百合主要病害、病原及检测方法

2.1百合主要真菌病害和病原真菌

百合的真菌病害主要有百合枯萎病、百合灰霉病和百合炭疽病（表1）。

2.1.1百合枯萎病

百合枯萎病可引起百合叶片、根和茎的腐烂，也被称为百合鳞茎腐烂病或百合根腐病，主要由镰刀菌属Fusarzurn真菌引起。作为一种由真菌引起的土传病害，百合枯萎病因发病频繁、危害严重受到学界关注，对于百合枯萎病的病原菌、发病机制、发病规律、防治措施等方面的研究不断深入。早在1960年就有从百合枯萎病株上分离到尖孢镰刀菌F．or-ysporum的报道。1992年，我国首次报道百合枯萎病。

近年来，从我国不同地区、不同品种百合的枯萎病病株上分离到多种镰刀菌，包括尖孢镰刀菌百合专化型F．orysporurn.f.sp.

lilii、串珠镰刀菌、层出镰刀菌、共享镰刀菌F．cornrnune、腐皮镰刀菌F．solani、三线镰刀菌F．tricinctum、烟草镰刀菌F．tabacinum、禾谷镰刀菌F．grarninearum。

2.1.2百合灰霉病（百合叶枯病）

百合灰霉病又称百合叶枯病，感病百合叶片上产生泪滴病斑，最终会导致百合病株完全落叶。早在1969年就有椭圆葡萄孢B．elliptica引起百合灰霉病的报道。在国内发现引起百合灰霉病的病原菌是椭圆葡萄孢和灰葡萄孢B．cinerea。

2.1.3百合炭疽病

百合炭疽病由刺盘孢属Colletotrichurn真菌引起，危害百合叶片、花和鳞茎等。叶片感病，产生黑褐色的病斑，后期叶片干枯至脱落；花感病，花瓣产生圆形或不规则的浅褐色病斑，后期组织溃烂变薄；鳞茎感病，外侧鳞片产生淡红色不规则的病斑，病健交界明显，后期病斑变成暗褐色并硬化，病斑合并使鳞片干缩呈黑褐色。引起百合炭疽病的病原菌有C．liliacearum、百合炭疽菌C．lilii和白蜡树炭疽菌C．spaethianum。

2.2百合卵菌病害和病原卵菌

由卵菌引起的百合疫病多发生在潮湿的雨季，发病初期百合病株的茎基部出现淡黄色水渍状腐烂，地上部表现为叶片变黄和植株萎蔫，后期百合病株的茎基部组织变黑变褐，维管组织变软腐烂，叶片由下至上变黄脱落，最后整株死亡。1992年，我国首次报道百合疫病的发生，从台湾省百合病株分离到的病原菌为寄生疫霉Phytophthora

para.sitica，后来从甘肃省和云南省百合病株分离到的病原菌为烟草疫霉P．nicotianae。

2.3百合病毒病和主要病毒

LMoV、CMV和百合无症病毒（lily symptom-less virus．LSV）是世界范圍内侵染百合最普遍且危害最严重的3种病毒，均是RNA病毒。LMoV由蚜虫非持续性传播，能系统侵染郁金香属和百合属植物，侵染百合的症状主要表现为叶片出现斑驳条纹甚至坏死斑，发展为开碎色花，花朵和叶片分叉卷曲，常伴随植株矮小，花与球茎减产等，造成花卉产量和质量的严重下降。CMV单独侵染百合时症状表现为叶片萎缩、黄化、变皱，茎部变形等。LSV由蚜虫传播，侵染百合后没有明显症状，但经常与CMV复合侵染百合，症状表现为植株矮小，叶片畸形，叶片产生褪绿斑或坏死斑点，花期缩短甚至不能开花等。因此，可根据复合侵染症状判断是否有LSV侵染。LSV也能侵染郁金香。

早期主要采用病株汁液摩擦接种、嫁接和介体传播等方法侵染指示植物，通过寄主反应鉴定病毒，或通过间接ELISA（I-ELISA）和双抗体夹心EIISA（DAS-EIISA）等免疫学方法特异性检测病毒，并结合电子显微镜观察病毒粒子的形态特征、内含体的有无和存在形态以及百合细胞和組织的病变情况进行鉴定。近期诊断鉴定植物病毒最常用的方法是RT-PCR和等温扩增。

目前，国际病毒分类委员会确认的大多数植物病毒的基因组全序列或部分序列已被测定，针对LMoV、LSV和CMV已知的RNA序列，设计特异性引物，利用RT-PCR技术能快速鉴定这3种病毒。近年来，RT-PCR技术在不断创新和发展之中，应用于检测鉴定LMoV、LSV和CMV的有多重RT-PCR技术、免疫捕获RT-PCR （IC-RT-PCR）技术、将多重RT-PCR技术和IC-RT-PCR技术结合的免疫捕获多重（三重）RT-PCR技术、实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）技术等。

LAMP技术是一种在恒温下依靠具有链置换活性的DNA聚合酶进行核酸扩增的技术，是检测植物检疫性病毒中应用最早、涉及类群最多的等温扩增技术。范小瑞将RT-PCR技术和LAMP技术结合，研制了LMoV、LSV和CMV的LAMP现场可视化快速检测试剂盒。而IC-RT-LAMP技术则将LAMP技术和IC-RT-PCR技术结合，用于检测LSV和CMV。

另外，王进忠等根据LMoV、LSV和CMV的核酸序列设计引物和探针，制备了基因芯片同时检测这3种病毒。袁志豪等从百合病株叶片提取RNA，进行高通量转录组测序，经序列分析发现了LMoV、LSV和CMV等8种病毒的序列，之后设计每种病毒的特异性引物，用RT-PCR检测验证转录组测序检测病毒的结果。

2.4百合线虫病和主要病原线虫

全国各地口岸截获线虫最多的植物是百合种球。截获的植物线虫主要隶属于滑刃属、真滑刃属Aphelenchus和短体属。

短体线虫为害严重，主要侵染百合根和鳞茎，侵染点处产生深褐色枯斑，鳞茎病部会成水渍状、腐烂，植株地上部发病初期局部叶片过早黄化，被害植株严重矮化，开花少且小。线虫产生的伤口易使植物遭受病原真菌和细菌侵染，加速植物组织腐烂。

草莓滑刃线虫Aphelenchoides fragariae是一种专性内外寄生线虫，寄主植物多样，分布范围广，主要靠种球、带芽苗木、接穗等无性繁殖材料传播，主要危害植物地上部分的腋芽、嫩叶和花序，病株矮化，枝弱叶稀，叶片畸形皱褶，顶芽凋枯，花少且畸形。草莓滑刃线虫为害百合引起百合黑死病，其取食地上部生长点，使新梢皱缩扭曲，不能开花，导致叶片从茎基部自下而上枯死。

3郁金香和百合病害病原检测鉴定方法的问题和展望

郁金香和百合病害病原中有些是中国进境植物检疫性有害生物，植物病原细菌中有郁金香黄色疱斑病菌、菊迪基氏菌、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌葱生致病变种；植物病毒中有南芥菜花叶病毒（arabismosaic virus）、草莓潜隐环斑病毒（strawberrylatent ringspot virus）和番茄环斑病毒（tomatoringspot virus）；植物病原线虫中有毛刺属线虫、拟毛刺属线虫、草莓滑刃线虫、马铃薯腐烂茎线虫Dit：ylenchus destructor和鳞球茎茎线虫D．dipsaci。这些检疫性植物病毒和病原线虫主要从进境的郁金香和百合种球中截获。另外，郁金香和百合的主要病原真菌镰刀菌、灰霉、炭疽菌危害大、扩散性强，在国内各产区间流行的风险高，有必要针对这些真菌加强对产区间调运种球的检疫。

建立方便、快速、准确和灵敏的病原检测鉴定方法，通过检疫从源头上防止病原随进口种球种苗传人国内和在国内各产区扩散，是防控郁金香和百合病害的最有效手段。本文所述的郁金香和百合病害的细菌、真菌和卵菌病原鉴定都用了传统的形态学、生物学和致病性测定，其中，多数研究仅用了传统鉴定方法，少数病原真菌的鉴定结合了核糖体RNA基因内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列的分析。仅用传统方法将病原鉴定到种的结论可靠性低。如，果胶杆菌属的多种细菌寄主广泛，不同种的菌株能侵染同种植物，产生相似的软腐病症，仅靠形态、生理生化和致病性状，不足以确定郁金香软腐病的病原是胡萝卜果胶杆菌。同样，对于真菌形态和症状相似的真菌病害和一些形态、生理生化特征随环境条件变化而变化的植物病原真菌，传统的鉴定方法难以鉴定到种。ITS序列呈现的真菌种间变异性和种内稳定性，为病原真菌的分子诊断提供了靶序列。针对ITS的PCR扩增、测序和序列分析能区别鉴定引起郁金香青霉病和灰霉病、百合灰霉病和炭疽病及百合疫病等病害的同属不同种的病原真菌和卵菌。但是，ITS序列用于镰刀菌的系统发育和物种鉴定的分辨率不高，只能将镰刀菌鉴定到复合种（species com-plex），如尖孢镰刀菌复合种Fusariurn oxysporurncomplex和藤仓镰刀菌复合种。翻译延伸因子基因序列用于镰刀菌的系统发育和物种鉴定的分辨率比ITS序列高很多。因此，包括TEF-1a的多基因序列分析能准确鉴定镰刀菌等病原真菌。在ITS、TEF-1a、RPB1和RPB2（编码DNA指导的RNA聚合酶亚基1和2）等序列分析的基础上，发展利用标准DNA片段对物种进行自动化鉴定的DNA条形码技术，能弥补传统分类鉴定方法在鉴定真菌病害病原中的不足。

准确地鉴定病原线虫物种也需要结合传统的形态学观察测量和现代分子生物学检测方法。线虫的ITS序列也呈现了线虫种间的变异性和种内稳定性，用ITS通用引物扩增目标线虫ITS序列，构建ITS序列的系统发育树，确定目标线虫在属内的系统发育地位；进一步可设计种特异的ITS引物和探针，建立鉴别目标线虫的PCR诊断方法，如王狲等设计了鳞球茎茎线虫特异TaqMan探针，建立了实时荧光PCR检测鳞球茎茎线虫的方法；王晨等构建了基于ITS序列的滑刃属线虫的系统发育树，并用种特异性引物扩增ITS序列，诊断目标线虫为草莓滑刃线虫。

传统分类鉴定病原的方法检测项目多、步骤多、周期长，不能满足快速检疫和基层现场检测的需求。qPCR和LAMP等分子检测技术快速、灵敏、通量高，检测效率依赖靶基因的分辨率和引物的特异性。测序技术的更新换代让病原微生物的全基因组序列呈几何级数增长，大规模比较基因组学分析能评估近缘物种共有序列的分辨率和发现区别近缘物种的标志基因。例如，最近的基因组学研究揭示，目前C．flaccu-faciens是包括多个种的复合种，其16S-23S rRNA基因间隔区序列的分辨率不足以区分C．flaccumfaciens复合种内的致病变种，此前依此建立的检测郁金香黄色疱斑病菌的qPCR方法的特异性还需更细致的检验。又如，比较基因组学分析发现FusariumOxysporumcomplex内各种菌的特有效应子基因，进而针对性地设计特异引物，采用PCR鉴别该复合种中的近缘物种。

相对于病原真菌、细菌和线虫，危害郁金香和百合的主要病毒的检测方法更为丰富。传统的生物学方法检测病毒致病性，电子显微技术观测病毒形态；免疫学方法以ELISA和免疫胶体金试纸条为主，需要特异的高效价抗血清或抗体。ELISA法检测灵敏度较高但操作复杂；免疫胶体金试纸条操作简便适合现场检测，但灵敏度较低，不适合检测早期无症状阶段含量较低的病毒。侵染郁金香和百合的主要病毒均为RNA病毒，RT-PCR检测RNA病毒的难点在于从植物组织提取RNA，提取过程中的RNA降解和逆转录体系中的RNA酶污染，都会导致检测假阴性。LAMP技术操作简单，快速直观，特异性强、灵敏度高、成本低，可实现病毒的田间诊断，但对引物要求高，一般用于单病毒检测。在RT-PCR技术上发展起来的RT-qPCR、多重RT-PCR和IC-RT-PCR，以及将RT-PCR技術和LAMP技术结合的RT-LAMP技术，相较于传统的RT-PCR技术，检测效率都有提升。同时，新的高效检测技术推陈出新，如重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA），数字PCR（digital PCR）和基于CRISPR/Cas系统（CRISPR： clustered regularly in-terspaced short palindromic repeat，规律间隔成簇短回文重复序列；Cas： CRISPR-associated protein，CRISPR相关蛋白）的检测技术。将这些技术应用到郁金香和百合主要病毒的检测检疫中，将为防控郁金香和百合病毒病提供可靠高效的技术支持。