辣椒中L型凝集素类受体激酶CaLecRKs鉴定及其对辣椒疫霉的响应

金庆敏 徐小万 衡周 王恒明 徐晓美

關键词：辣椒；L型凝集素类受体激酶；辣椒疫霉；基因表达；诱导

类受体激酶（receptor-like kinases，RLKs）是一个庞大的蛋白家族，主要负责环境胁迫（括生物和非生物）和发育信号的感知和转导。凝集素类受体激酶（lectin receptor-like kinases，LecRKs）是RLK家族的一类成员，它们含有能够结合各种碳水化合物的胞外凝集素基序，根据所含凝集素基序的差异，凝集素类受体激酶分为3种类型，分别为G型、C型和L型。其中L型凝集素类受体激酶含有胞外豆类凝集素样结构域和胞内激酶结构域。现有研究报道发现，LecRKs能够参与多种生物过程，包括花粉发育、种子萌发、伤害胁迫和盐胁迫等，而其最突出的作用是参与植物的先天免疫。

目前，模式植物拟南芥Arabidopsis thaliana中的AtLecRK基因功能研究得最为清楚。拟南芥中共鉴定出45个AtLecRK基因，其中包括7个“Sin-gleton”，另外38个AtLecRK基因可划分为9个分支。Wang等通过插入T-DNA对拟南芥45个AtLecRK基因的功能进行了系统研究，发现有多达18个AtLecRK基因的T-DNA插入突变体对油菜疫霉Phytophthora brasszcae、辣椒疫霉Phyto-phthora capszcz、丁香假单胞菌Pseudornonas syrin-gae或甘蓝链格孢Alternaria brasszczcola的抗性发生了改变。AtLecRK-I.9缺陷型突变体在细胞壁相关防御和茉莉酸信号传导方面受损，并对丁香假单胞菌、油菜疫霉和辣椒疫霉表现出更高的易感性。尽管作用机制不同，AtLecRK-Ⅵ．2和AtLecRK-V．5都被发现在对抗病原细菌的气孔免疫中发挥作用。AtLecRK-Ⅵ．2奕变体不能通过气孔关闭抑制细菌入侵，因此对细菌更敏感，但对真菌或卵菌不敏感，而AtLecRK-V．5突变体则相反，其通过关闭气孔来提高植物对病原细菌的抗性。拟南芥AtLecRK第Ⅸ分支的2个基因AtLecRK-Ⅸ．1和AtLecRK-Ⅸ．2均在调节植物对疫霉抗性上发挥重要作用。并且有研究发现在番茄和烟草中与拟南芥AtLecRK第Ⅸ分支同源的LecRK基因也参与植物的抗疫霉防御反应。此外，黄瓜中CsLecRK6.1同样受瓜类疫霉和辣椒疫霉诱导。由此可见，LecRK基因家族在植物抗病防御反应中发挥着重要功能。

辣椒Capsicurn annuurn因其风味多样、营养丰富，深受消费者喜爱，其既可鲜食又可加工，具有重要的产业价值。由辣椒疫霉引起的辣椒疫病是辣椒生产上常见的主要病害之一，是一种发病周期短、传播速度快的毁灭性土传病害，在世界范围内均有发生。从长远来看，在辣椒抗疫病品种中挖掘抗辣椒疫霉的相关抗性基因是一种安全、经济、有效的防治途径。

目前为止，未见在辣椒中全基因组范围鉴定LecRK基因的报道。为了初步探究辣椒中的Lec-RK基因是否参与辣椒的抗疫病防御反应，我们对辣椒基因组中的CaLecRK进行了全面鉴定，并分析了辣椒CaLecRK与番茄SILecRK和拟南芥AtLec-RK的系统发育关系。同时，以抗疫病辣椒材料‘CM334’和感病材料‘10399’为试验材料，在接种辣椒疫霉后（0、12h和36h）利用RT-qPCR技术分析CaLecRK基因的表达变化，旨在挖掘参与辣椒抗疫病防御反应的CaLecRK基因，为辣椒抗疫病育种提供基因资源。

1材料与方法

1.1植物材料及培养

‘CM334’和‘10399’均受赠于美国墨西哥大学Paul W. Bosland教授。‘CM334’高抗辣椒疫霉，而‘10399’对目前测试的所有辣椒疫霉都敏感。试验材料均在广东省农业科学院蔬菜研究所植物培养室采用育苗杯种植，每杯播种5粒种子。育苗条件为：温度（26±2）℃，光周期L∥D=14h∥10h，相对湿度70%。幼苗生长至6片真叶时进行接菌处理。

1.2疫霉培养、菌液制备及接菌处理和取样

辣椒疫霉培养：本研究所用辣椒疫霉菌株为By14，该菌株于2012年在广东省农业科学院广州白云试验基地的感病辣椒植株上分离获得。将保存的By14茵株于V8固体培养基（200mL V8果蔬汁，3.0g CaC03，20g琼脂，800mL无菌水，pH6.3）上活化培养。先置于25℃环境下黑暗培养3d，而后在L∥D=12h∥12h条件下培养3～4d，用于诱导产孢。

菌液制备：在平板中加入10mL无菌水，将其置于4℃冰箱静置30min，再于室温下（23～25℃）放置30min释放孢子，收集孢子悬浮液，并用血球计数板计数游动孢子数量，调节至游动孢子浓度为1×104个/mL备用。

接菌处理：接菌前12h将辣椒幼苗浇透水，用注射器吸取5mL游动孢子悬浮液注射至距植株约1cm左右的根际处，黑暗保湿24h后在上述正常育苗条件下培养。分别在接菌后0、12h和36h取样，每个材料每个时间点取3个单株的根部进行混样，将根部快速冲洗干净后存放于液氮中备用。每个样重复3次。

1.3辣椒基因组中CaLecRK蛋白的鉴定

参考Wang等对烟草和番茄基因组中Lec-RK蛋白的鉴定方法，根据Bouwmeester等分析的拟南芥AtLecRK蛋白，从TAIR网站（https：∥www.arabidopsis. org/）检索并下载45条拟南芥AtLecRK蛋白序列，以此作为查询序列在茄果类基因组数据库网站（https：∥solgenomics．net/tools/blast/）利用blastP工具在系统默认检索参数下对辣椒‘CM334，基因组蛋白数据库（1. 55版本）进行检索，检索到的蛋白序列初步过滤后采用蛋白质结构域和基序注释网络工具SMART（simple modulararchitecture research tool）（http：∥smart. embl-hei-delberg. de/smart/set_mode. cgi？

GENOMIC=1）进行注释，同时含有凝集素结构域和激酶结构域的蛋白被认定为CaLecRK。

1.4辣椒中CaLecRK的蛋白结构预测

使用蛋白质结构域鉴定、注释在线分析工具SMART在genomic模式下完成CaLecRK蛋白质结构域的鉴定和注释，包括凝集素基序、蛋白激酶结构域、跨膜结构域等，同时使用在线工具SignaIP6.0（https：∥servlces. healthtech. dtu. dk/service.php？ SignaIP）进行CaLecRK的信号肽预测。

1.5CaLecRK蛋白系统发育分析

从茄果类数据库（https：∥solgenomics。net/cview/map．pl？

map_id=10）下载检索到的目标CaLecRK蛋白序列，以MEGA 11軟件的Clust-aIW模块进行CaLecRK蛋白的多序列比对，并以邻接法（neighbour-joining，NJ）构建CaLecRK的系统发育树，bootstrap设为1000。22个番茄LecRK蛋白序列来源于文献，38个（不包括7个“Single-ton”）拟南芥LecRK蛋白序列ID从文献[2]获取，再从拟南芥数据库（https：∥www. arabidopsis.org/）下载其蛋白序列。

1.6RNA提取及RT-qPCR基因表达分析

根据CaLecRK蛋白序列ID在茄果类基因组数据库（https：∥solgenomics. net/cview/map. pl？ map_id=10）下载24个CaLecRK基因CDS序列，利用Primer Premier 6.0设计引物（表1），并交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物经过特异性检测和熔解曲线分析合格后用于后续RT-qPCR试验。总RNA提取、反转录及RT-qPCR参考徐晓美等的方法，选取CaIF4G （CAOlg27330）为内参基因。基因相对表达量参考Wang等的方法计算。以接种辣椒疫霉后oh样本为参照计算差异表达倍数，当其他时间点（接菌后12h和36h）基因的相对表达量与0h的差异达到2倍及以上，即log2（fold change）≥1或log2（fold change）≤-1时认为表达存在显著差异。

2结果与分析

2.1CaLecRK鉴定及其结构分析

以拟南芥中45条AtLecRK蛋白序列为查询序列，在辣椒‘CM334’蛋白数据库（1.55版本）中共比对到198条蛋白序列，根据LecRK蛋白长度特征，过滤掉长度大于800aa和小于320aa的蛋白，剩下的112条蛋白序列再经过逐一核对和结构域分析，有24个蛋白被鉴定属于LecRK家族。通过序列比对，将这24个CaLecRK锚定到‘CM334’辣椒基因组上获取其对应的基因ID，发现其中20个CaLecRK基因分布在辣椒第1～10号染色体上，其中第1、5、6、7和8号染色体上各分布1个，第2、3和4号染色体上各分布2个，第9和10号染色体上分别分布有4个和5个，第11和12号染色体上暂未发现有分布（表2）。另外有4个CaLecRK不能锚定到目前版本的辣椒染色体上。根据20个CaLecRK在各染色体上的顺序对其进行命名，4个（CAOOg16600、CAOOg16660、CAOOg16670和CAOOg44720）未能锚定到具体染色体上的CaLecRK基因依次命名为CaLecRK00.1、CaLecRK00.2、CaLecRK00.3和CaLecRK00.4<表2）。

24个CaLecRK大小介于375～716aa之间，蛋白结构分析表明，凝集素基序位于CaLecRK的N末端，大小为134～265aa，蛋白激酶结构域位于CaLecRK的C末端，大小为65～274aa（表3）。24个CaLecRK均含有跨膜结构域，其中12个CaLecRK（CaLec-RK1.1、CaLecRK2.1、CaLecRK2.2、CaLecRK3.2、CaLecRK4.1、CaLecRK4.2、CaLecRK7.1、CaLec-RK8.1、CaLecRK9.1、CaLecRK9.4、CaLecRK10.1和CaLecRKOO.2）含有1个跨膜结构域，10个Ca-LecRK（CaLecRK3.1、CaLecRK5.1、CaLecRK6.1、CaLecRK9.2、CaLecRK9.3、CaLecRKIO.2、CaLec-RK10.3、CaLecRK10.4、CaLecRK10.5和CaLecRK00.4）含有2个跨膜结构域，另外还有2个CaLecRK（CaLecRK00.1和CaLecRK00.3）含有3个跨膜结构域（表3）。信号肽预测表明，除Ca-LecRK3.1、CaLecRK4.1和CaLecRK9.4等3个CaLecRK不含有信号肽片段外，其他21个CaLec-RK均含有信号肽（表3）。

2.2CaLecRK蛋白的多序列比对和系统发育分析

基于24个CaLecRK蛋白的系统发育树分析表明，24个CaLecRK可分为7个分支，其中第工分支含有的CaLecRK个体最多，为9个，第Ⅳ和第Ⅶ分支各含有4个CaLecRK，第V和第Ⅱ分支分别由3个和2个CaLecRK组成，第Ⅲ和第Ⅵ分支均只含1个CaLecRK（图1）。

2.3拟南芥、番茄和辣椒中LecRKs的进化分析

为了评估不同植物物种的LecRK之间的进化关系，本研究对38个拟南芥AtLecRK，22个番茄SILecRK和24个辣椒CaLecRK进行了系统进化分析，结果表明，84个LecRK可分为10个分支，其中拟南芥中绝大多数AtLecRK集中分布在第Ⅱ、Ⅳ、V和Ⅵ这4个分支，而辣椒中CaLecRK和番茄中SILecRK绝大多数分布在第Ⅲ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和X这5个分支（图2）。其中，第Ⅱ、V和Ⅵ分支只包含拟南芥AtLecRK，而第Ⅲ和X分支只包含辣椒CaLecRK和番茄SILecRK，通过LecRK之间的系统进化关系分析可以看出，这3种植物之间既有相似性又存在特异性。

2.4辣椒疫霉胁迫下CaLecRK基因的表达分析

为进一步探究辣椒中哪些CaLecRK参与了辣椒抗疫病防御反应，将辣椒疫霉接种到高抗辣椒疫霉的‘CM334’和感病材料‘10399’的幼苗上，以接种后Oh根茎中CaLecRK基因表达量为参照，分析接菌后12、36h根茎部24个CaLecRK基因表达情况。结果表明，24个CaLecRK基因中有4个受辣椒疫霉诱导，基因表达与Oh相比显著上调，其中CaLecRK2.2和CaLecRK8.1表达模式相同，均只在抗病材料‘CM334’中显著上调表达，且都在接菌后36h表达量达到最高；CaLecRK3.2在抗病材料‘CM334’和感病材料‘10399’中均显著上调表达，并在接菌后12h表达量达到最高，接菌后36h有所下降，但在抗病材料‘CM334'中的差異表达倍数均高于对应时间点在感病材料‘10399’中的差异表达倍数（‘CM334’中接菌后12 h和36h对比0h差异表达倍数分别为3.9和3.7倍，‘10399’中分别为2.9和2.2倍）；CaLecRK10.1只在抗病材料‘CM334’中显著上调表达，并在接菌后36h表达量达到最高（图3）。4个显著差异表达基因中，CaLecRK8.1差异表达倍数最高，达到了4倍以上。以上结果可以看出这4个CaLecRK基因均受辣椒疫霉诱导，推测其参与辣椒抗疫病防御反应。

3结论与讨论

目前已在3个茄果类作物中鉴定到了L型凝集素类受体激酶基因，其中番茄中有22个SILecRK，烟草有38个NbLecRK，马铃薯中有26个StLec-RK。本研究在辣椒基因组中鉴定到的CaLecRK基因有24个。从数量上来看，除烟草外，在番茄、马铃薯和辣椒3个茄果类作物中所携带的LecRK基因数量相当，这可能主要和这4种作物的基因组构成有关，番茄、马铃薯和辣椒均为2n=24的作物（马铃薯有多种染色体倍型，但本文参考的文献中为2n=24），而烟草为异源四倍体作物，导致烟草中的LecRK基因数量远多于其他3个作物。虽说辣椒基因组远大于番茄基因组（约为4倍），但其所携带的LecRK基因数量非常接近，并且LecRK基因在染色体上的分布也极为相似，番茄中22个SILecRK分别分布在第1、2、3、4、5、7、9和10号染色体上，本研究辣椒中20个CaLecRK分别分布在第1、2、3、4、5、6、7、9和10号染色体上，剩余4个未知（表2），且都是第9和10号染色体上分布最多。基因串联重复事件在植物基因组中经常发生，基于串联重复基因位于10个相邻基因内的标准．本研究中发现了3组串联重复基因对，分别是CaLecRK9.1（CA09905510）和CaLec-RK9.2（CA09905520）， CaLecRK10.4（CAlOg19240）和CaLecRK10.5（CA10g19270），CaLecRK00.1（CA00g16600）、CaLecRK00.2（CA00g16660）和CaLecRK00.3（CA00g16670），类似现象在番茄Sl-LecRK基因中也存在，随着物种的进化，基因串联事件发生会导致同一基因家族基因数量的改变，从而为物种适应环境提供保障。

L型凝集素类受体激酶基因LecRK广泛参与植物对细菌、真菌、卵菌和昆虫等的免疫反应。本研究结果发现辣椒中的CaLecRK2.2、CaLec-RK3.2、CaLecRK8.1和CaLecRK10.1等4个基因受辣椒疫霉诱导，推测其参与辣椒抗疫病防御反应。在拟南芥中，AtLecRK-Ⅸ．1和AtLecRK-Ⅸ．2的T-DNA插入突变体对油菜疫霉和辣椒疫霉的抗性降低，而AtLecRK-Ⅸ．1或AtLecRK-Ⅸ．2在拟南芥中的过量表达和在烟草中的瞬时表达均能增强植株对疫霉的抗性，表明这2个基因均能正向调控植株对疫霉的免疫反应。进化分析表明烟草和番茄中的3个LecRK基因（NbS0003475290003.1、NbS0005953890001.1和So/yc039043710.1.1）与AtLecRK-Ⅸ．1或AtLecRK-Ⅸ．2归属于同一分支，为同源基因。利用病毒诱导的基因沉默对其功能进行分析表明，这3个基因同样在植株对疫霉抗性中发挥重要作用。本研究中进化分析表明，CaLec-RK8.1与AtLecRK-Ⅸ．1或AtLecRK-Ⅸ．2也归属于同一分支，且受辣椒疫霉诱导，推测CaLecRK8.1参与辣椒抗疫病防御反应，综上显示Ⅸ分支的LecRK基因在不同植物家族中功能保守。

现有研究表明，辣椒CaLecRK-S．5在转录水平上正向调节植物免疫，通过调节基因是否启动转录来介导对烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus）、辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus）和辣椒疫霉Phytophthora capsici等的广谱抗性。进一步在烟草中通过功能获得和功能缺失分析表明，Ca-LecRK-S.5在以疫霉Phytophthora作为诱导子介导的防御反应中发挥积极作用。序列比对发现，CaLecRK-S．5和本研究中的CaLecRK4.1为同一个基因，然而本研究中，CaLecRK4.1基因在辣椒疫霉处理前后并未呈现出显著表达差异（图3），这可能和所用辣椒疫霉的生理小种不同有关，因辣椒疫霉存在生理小种分化，同一抗病材料对不同致病菌的抗性存在明显差异，即同一抗病材料对不同辣椒疫霉生理小种的响应机制可能不同。