梨园气溶胶中梨火疫病菌的定量检测

荆琚 王杰花 韩丽丽 陈卫民 吴品珊 雷荣

关键词：梨园；气溶胶；梨火疫病菌；定量检测

解淀粉欧文氏菌Erwinia arnylouora被列为我国重大检疫性细菌，其引起的梨火疫病于2015年6月首次在新疆伊犁地区霍城县发现并暴发流行，现已蔓延至新疆14个地州（市），严重危害梨、苹果、山楂、海棠、榀椁等果树，尤其在库尔勒香梨上传播极为迅速，给新疆乃至全国林果产业带来严重威胁。2017年，苹果在中国的种植面积约222万hm2，产量382万t；梨种植面积约107万hm2，产量1289万t，种植面积和产量均为世界第一。我国梨每年的出口值超过2亿美元，是世界上最大的梨出口国之一，也是我国农业重要的经济来源之一。因此，梨火疫病害一旦传播至国内其他省份，将造成巨大损失。

细菌、真菌、病毒、噬菌体等微生物可附着在气溶胶包含的固体或液体颗粒上，以独立个体或聚集体的形式在空气中扩散，造成病原微生物的长距离传播和入侵。迄今，大部分研究认为梨火疫病菌主要通过伤口、自然孔口和花侵入寄主，进而侵染韧皮部组织、花丝及柱头，引起组织发病，而通过在种植苹果的模拟苗圃中研究风雨形成的气溶胶在梨火疫病传播流行中的作用，发现大多数疫情都与流行之前发生的风暴有关。梨火疫病菌在相对湿度为40%～90%的空气粒子中可存活较长时间。目前自然条件下国内梨园气溶胶携带梨火疫病菌情况未见报道。因此，本研究于2019年-2021年收集了新疆库尔勒市人和农场‘香梨’园中的气溶胶，对其中可能携带的梨火疫病菌进行检测，为掌握梨火疫病的传播途径提供技术依据，对库尔勒香梨产业的可持续发展具有理论和实践意义。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1梨园基本概况

试验地位于新疆巴州库尔勒人和农场，共12个梨园，经纬度：41°40'N～41°49'N，85°59'E～85°47'E，海拔：907.5～928m，株行距：3m×5m，每个梨园面积0.67hm2，共计8.04 hm2。其中健康（不发病）梨园3个、轻度发病（病情指数1.00～10.00）梨园3个、中度发病（病情指数10.01～30.00）梨园3个、重度发病（病情指数30.01以上）梨园3个，种植品种‘香梨’。土质为沙壤土，土壤肥力中等，地势平坦，排灌方便，井水灌溉，栽培条件（施肥量、灌水等）均匀一致，符合当地实际林业生产。

1.1.2致病性测试材料

2019年4月-2021年6月，采集库尔勒市绿化4队行道树上未喷任何药剂、健康的当年生‘香梨’树嫩枝条、叶片、幼果，供离体接种使用。巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院温室秋季栽植2年生‘小叶刺’杜梨Pyrus betulifolia苗，供次年活体接种使用。

1.1.3标准菌株

梨火疫病菌标准菌株（编号：E．aY2003，寄主：苹果），由南京农业大学胡白石教授提供。

1.2试验方法

1.2.1梨园气溶胶中梨火疫病菌收集方法

2019年-2021年，每年春季（4月下旬）、夏季（6月中旬）、秋季（9月中旬）3个季节，将病原菌孢子捕捉器（河南云飞科技发展有限公司）放置于梨园中两行‘香梨’树中间，载玻片（长×宽=8cm×3cm，采集面积为24cm2）上涂抹凡士林后放入孢子捕捉器内并设定放置时间。收集完成的载玻片样本放入50mL无菌离心管中，带回实验室用移液器吸取5mL无菌水重复冲洗载玻片6次，制備成气溶胶悬浮液，置于4℃冰箱保存备用。病原菌孢子捕捉器放置按照以下3种方法：

1）重度发病梨园不同空间高度收集：在梨园中两行‘香梨’树的中间，距离梨树2.5m处放置孢子捕捉器，设置3个放置高度，分别距地面50、100、150cm，每个高度放置1个孢子捕捉器，重复3次，收集时间1h。

2）不同发病程度梨园收集：在健康、轻度、中度、重度发病4种梨园，每种梨园选择3个，每个梨园在两行梨树中间距地面高度100cm处放置1个孢子捕捉器，重复3次，收集时间1h。

3）同一高度不同时间收集：在重度发病梨园的同一株香梨树下，距离树干2.5m，距地面高度100cm处放置孢子捕捉器，收集时间分别设置为2、5、10、15、20、30、45、60min，每个时间点重复3次，共计24份样本。

1.2.2病原菌分离、纯化

接种环蘸取气溶胶悬浮液在牛肉膏蛋白胨（NA）培养基上划线分离，28℃，倒置培养48h后观察菌落形态。挑取乳白色、表面光滑且凸起、有光泽的疑似单菌落，转皿至新鲜NA培养基上，重复操作3次，用于后续致病性测定。

1.2.3致病性测试

1.2.3.1接种菌悬液制备

将从气溶胶中分离纯化得到的96株疑似梨火疫病菌菌株转接到NA培养基平板上，28℃培养48h，挑取单菌落接种于NB培养液中，28℃、150r/min振荡培养24h，将OD600值为0.4的菌液作为接种菌悬液。

1.2.3.2离体枝条接种

采集生长一致的健康一年生‘香梨’枝条，剪成25cm茎段，75%乙醇消毒后，插入装有无菌水的三角瓶中，每瓶插入1个枝条。用喷壶将1×108 cfu/mL的菌悬液均匀喷在待接种枝条上，每处理接种3个枝条，重复3次，以无菌水为对照。接种后置于室内培育架上，在L∥D=12h∥12h，温度27～28℃、相对湿度75%条件下培养，记录发病情况。

1.2.3.3梨幼果接种

取健康‘香梨’幼果用70%乙醇浸泡10min后，用灭菌解剖刀横切为二，用灭菌牙签蘸取浓度为1×108cfu/mL菌液分别在两个横切面上均匀接种6个点，然后放入90mm培养皿中，培养皿放置于铺灭菌吸水纸的托盘中，保鲜膜封口，在L∥D=12h∥12h，27～28℃条件下保湿培养。记录梨幼果菌脓出现的时间。

1.2.3.4离体叶片接种

设置接种菌液浓度为1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109cfu/mL，以无菌水为对照，共8个处理，每处理接种3片香梨叶片，重复3次。挑选健康、生长期一致的叶片，置于垫有灭菌湿滤纸的90mm培养皿上。用灭菌牙签在叶片基部叶柄处针刺1个伤口，取5uL菌液滴在伤口处，培养条件同1.2.3.3。记录叶片发病情况。

1.2.3.5温室幼苗接种

用灭菌牙签在盆栽‘小叶刺’杜梨苗枝条上针刺10处伤口，将浓度为1×108cfu/mL的菌悬液均匀地喷于待接种枝条上，1盆杜梨幼苗为1个处理，重复3次，无菌水为对照，其他条件同上，接种后5～7d调查记录发病情况。

1.2.4致病菌的再分离

1.2.4.1温室幼苗、幼嫩组织致病菌再分离

取离体枝条发病幼茎（剪成0.5～1cm的小段）、离体发病叶片（剪成1×1cm左右小块）和温室发病幼苗枝条，先用75%乙醇表面消毒30s，再用1%次氯酸钠消毒1min，无菌水冲洗3遍，用灭菌吸水纸吸干水分后转移至研钵中，加入PBS缓冲液研磨，浸泡15min，使用接种环蘸取研磨液，在NA培养基平板划线分离。

1.2.4.2梨果实致病菌再分离

发病梨果保湿培养5d后，取变黑腐烂的果实，挑取果实表面菌脓或腐烂物，在NA培养基上划线分离。

1.2.5致病菌的测序鉴定

1.2.5.1总DNA提取

选取致病性测试后有发病症状的组织，用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司），参照说明书提取总DNA。

1.2.5.2PCR扩增及测序

参照胡白石、袁英哲等方法，使用梨火疫病菌的特异性引物P29B/P29A进行PCR扩增。PCR扩增体系（25uL）：2×Taq PCR mix 12.5uL，引物P29B/P29A（10umol/L）各1uL，DNA uL，ddH90 9.5uL;反应程序：95℃预变性5min; 94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸8min。选取阳性产物送至北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司双向测序，所得序列在NCBI中进行BLAST比对分析。

1.2.6气溶胶中梨火疫病菌的定量检测

1.2.6.1气溶胶样品处理与DNA提取

从重度、中度和轻度发病的果园中分别随机选取10份气溶胶样本，用无菌水冲洗载玻片收集的气溶胶样本于50mL无菌离心管中，12000r/min离心10min，弃上清，用200uL无菌水冲洗离心管底部，混匀，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。

1.2.6.2荧光定量PCR反应体系与反应程序

参照袁英哲等，钱国良等的方法进行荧光定量PCR。使用AceQ Universal U+Probe MasterMix（Vazyme）进行PCR扩增，每个样品重复3次，以无菌超纯水为阴性对照。反应体系（20uL）：Mix 10 uL，10umol/L上、下游引物各1.5uL，探针0.4uL，DNA模板2.0UL，超纯水补足至20uL;扩增条件：95℃ 5min；95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。检测引物及探针序列分别为：Ams116F（5'-TCCCACATACTGTGAATCATCCA-3'）， Arns189R（5-GGGTATTTGCGCTAATTTTATTCG-3'），和Ams14IT （5'-FAM-CCAGAATCTGGCCCGCGT-ATACCG-TAMRA-3'）。

1.2.6.3标准曲线制作

利用细菌浊度计对培养的标准菌株（E．aY2003）菌悬液进行计数，并把菌悬液稀释到1×108 cfu/mL，再进行5倍梯度稀释，得到1×108、2×107、4×106、8×105、1.6×105、3.2×104 cfu/mL的标准菌液。各取2．0uL菌液为模板进行荧光定量PCR，根据Ct值与菌液浓度对数值的线性关系制作标准曲线，并拟合标准曲线，得到定量计算方程。根据检测样品的Ct值，由方程计算检测样品的菌落数。

2结果与分析

2.1气溶胶中梨火疫病菌的分离结果

2019年-2021年在梨园中共采集气溶胶样本1368份，分离出携带疑似梨火疫病菌的样本96份（表1）。健康梨园内未分离到梨火疫病菌；春季仅在重度梨园内分离到疑似梨火疫病菌；夏季健康，轻、中、重度发病梨园中均未分离到疑似梨火疫病菌；秋季梨園中分离到的疑似梨火疫病菌较多。重度发病梨园同一高度（100cm），收集时间为2、5、10、15min时没有分离到疑似梨火疫病菌，收集时间为20、30、45min和60min时可分离到疑似梨火疫病菌，收集时间越长分离到病菌的气溶胶样本越多。分离出的96份疑似梨火疫病菌样本，其中春季28份，夏季0份，秋季68份。

2.2致病性测定结果

2019年，对分离出的27份疑似梨火疫病菌菌株进行致病性测定，其中离体枝条接种、果实接种、温室盆栽杜梨苗接种，菌悬液浓度为1×108 cfu/mL时可致病，离体叶片接种在菌悬液浓度为1×105～1×109cfu/mL均可致病。

2020年，对分离出的34份疑似梨火疫病菌菌株，使用离体枝条接种法、温室盆栽杜梨苗接种法进行致病性测定，在菌悬液浓度为1×108 cfu/mL时可致病。

2021年，对分离出的35份疑似梨火疫病菌株，使用离体枝条接种法、果实接种法进行致病性测定，菌悬液浓度为1×108 cfu/mL时可致病（图1）。

2.3接种致病菌的梨样品PCR检测

剪取致病性测定后有发病症状的叶片、枝条、果实，提取基因组DNA进行PCR检测，均扩增得到900bp的片段（图2）。对PCR扩增产物进行双向测序，在GenBank中进行序列比对分析，结果表明，所得序列与GenBank中（登录号：CP050241.1）的序列相似性在99%以上，确定为梨火疫病菌（表2）。

2.4标准菌液标准曲线制作

标准曲线制作结果显示，每个浓度重复检测3次，结果基本一致，重复性较好。得到的标准曲线方程为：y=-3.191x+48.007。R2为0.996，可信度较高。扩增效率（E）为105.8%，扩增效率较理想。同批检测样品的Ct值带入定量计算方程式便可获得总菌落数cfu/（24cm2．h）。

2.5梨园气溶胶样本的实时荧光定量PCR检测

病原孢子捕捉器从重度、中度和轻度发病梨园气溶胶中收集到的病菌，通过实时荧光定量PCR检测（表3），结果均为阳性。从30份样品中均可检测出不同数量的梨火疫病菌，其中最高值2. 81×104 cfu/（24cm2．h），最小值8.50×102 cfu/（24cm2·h）。重度发病果园总菌落数平均值为8.74×103cfu/（24cm2．h），中度发病果园总菌落数平均值为4.55×103 cfu/（24cm2·h），轻度发病果园总菌落数平均值为2.36×103 cfu/（24cm2·h）。健康果园在3个季节的气溶胶检测中均未测到梨火疫病菌，在轻度、中度、重度发病果园内气溶胶中检测出梨火疫病菌。且气溶胶中的梨火疫病菌含量与果园田间发病程度呈正相关性。

3结论与讨论

梨园气溶胶中梨火疫病菌分离试验结果显示，在春季（4月下旬）、夏季（6月中旬）采集的气溶胶样本中，春季只有重度发病梨园中携带梨火疫病菌，夏季检测不到梨火疫病菌，而秋季（9月中旬）在不同发病程度梨园采集的气溶胶中均检测到梨火疫病菌，说明秋季梨园空气中气溶胶携带梨火疫病菌的浓度高于春季、夏季梨园。该试验结果与梨园梨火疫病发病规律相符。春季为果树生长初期，梨火疫病发病率低，扩散至空气中的病菌少，因此只有重度发病梨园检测到梨火疫病菌；夏季是果树生长期，气温较高，在30℃以上（梨火疫病的适宜温度为25～28℃），不利于梨火疫病菌的繁殖和扩展蔓延；秋季，经过整个生长季节的积累以及适宜的气候条件（秋季有一定量的雨水），梨火疫病发病率高，扩散至空气中的梨火疫病菌也较多，随着空气的流动，整个疫区梨园空气中均携带梨火疫病菌。因此，根据秋季是梨火疫病发病高峰期的特点，秋冬季防控应以修剪病枯枝、药剂清园为主，即在9月下旬至10月中旬果实采收后进行清园，对病枯枝进行全面修剪并及时清除，同时选用46%氢氧化铜水分散粒剂或33.5%喹啉铜悬浮剂进行药剂清园，喷淋树体，降低病原越冬基数。

Southey等报道，梨火疫病菌在相对湿度40%～90%时附着在空气中小颗粒表面可以很好地存活下来，模拟气溶胶在露天环境暴露2h仍有大量病菌存活。含有欧文氏菌Erwinia spp．的气溶胶至少可存活1h。Crosse等研究发现，在良好的环境条件下，叶片损伤是苹果芽感染解淀粉歐文氏菌E．amylooora的诱发因素，气溶胶落在苹果芽上，细菌会迅速繁殖，苹果感染E．arnylouora与风导致的叶片损伤有关。尽管每个气溶胶颗粒携带细菌数量很低，但其可能是E．arnylovora流行病学上的重要来源。McManus等的研究也表明，风、降雨是E．arnylovora在苗圃中传播的最重要因素，他们利用空气微生物采样器收集空气样本，调查了梨火疫病菌在风雨形成的气溶胶内悬浮的可能性，结果在所有收集的风雨形成的空气样本中均检测到梨火疫病菌，而在干燥空气中收集的样本几乎不含病菌。本试验夏季梨园气溶胶样本中检测不到梨火疫病菌的结果与此结果相符。

本试验采用病原孢子捕捉器有效地收集到梨园气溶胶中的梨火疫病菌，且气溶胶中携带的梨火疫病菌具有致病性。由此推断梨园气溶胶中携带的梨火疫病菌可能造成梨火疫病流行，是梨火疫病的传播途径之一。