结直肠癌中性粒细胞胞外诱捕网研究进展

贾栋，陈顺，解有成，康殷楠，赵宝银，仵朝晖，王俊科，于晓辉

（1.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院 消化内科，甘肃 兰州 730050；2.甘肃中医药大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000）

中性粒细胞作为固有免疫中最重要的免疫细胞之一，同时也是机体抵御外界微生物的第一道防线，可通过吞噬及脱颗粒作用介导抗菌活性，从而进行免疫防御，杀灭病原体。此外，活化的中性粒细胞还可向胞外释放一种由解聚的DNA 染色质和多种颗粒蛋白构成的网状结构物，即中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs），可捕获病原微生物并分泌抗菌蛋白对其杀灭，是一种先天性免疫胞外防御机制，但过度激活的NETs 可进一步级联炎症反应。近年来已证实NETs 与自身免疫性疾病、糖尿病、心血管疾病、癌症等多种非感染性疾病的发生发展密切相关。大量动物模型和肿瘤患者研究表明，NETs 形成参与结直肠癌（colorectal cancer，CRC）进展和转移。笔者就CRC 的NETs 相关研究进展进行综述，旨在为深入理解CRC 发生发展过程提供新依据。

1 NETs的基本结构及形成机制

1996年，Takei 等[1]首次发现中性粒细胞在佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA） 的刺激下，出现分叶核解聚，核膜及细胞膜破裂等特殊的死亡形态变化。随后Brinkmann 等[2]通过进一步的验证，将这种不同于细胞凋亡和坏死的新型特异性细胞死亡方式定义为NETs，NETs 由去聚化的染色质DNA 为骨架，其中镶嵌多种活性蛋白，包括组蛋白、组织蛋白酶G（cathepsin G，CG）、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、防御素、抗菌肽LL-37 等30 多种蛋白和酶，可以固定病原体并将其暴露于局部高致死性浓度的效应蛋白。在高分辨率扫描电镜观察下，NETs 表现为一种独特的超微机构，由直径约为15～17 nm 的平滑的核染色质纤维和直径为25～50 nm 的球形结构域组成。

中性粒细胞产生NETs 的过程被称为NETosis，其过程受到多种通路和机制的调节，可由多种刺激物激活产生，如病毒、真菌、细菌及其细胞壁成分、免疫复合物、细胞因子和趋化因子等。如图1 所示，NETosis 主要有两种形成方式：细胞溶解性NETs 和活性NETs，前者过程发生较慢，一般需要2～6 h，具体为中性粒细胞在受到PMA 等炎症或化学刺激后，内质网中的钙离子释放进入胞浆，激活并通过PKC/Raf-MERK-ERK 信号通路活化非烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH） 氧化酶[3]，从而引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）的释放[4]，随后胞浆内的NE 和MPO 转运入核，降解组蛋白并促进染色质去浓缩。另外，活化的肽酰基精氨酸脱亚氨酶4 （peptidyl arginine deaminase 4，PAD4）对组蛋白起到翻译后修饰的作用，介导组蛋白H3瓜氨酸化，减少组蛋白与DNA 之间的静电引力[5]，进一步导致染色质解聚，胞内容物释放到胞外形成NETs。后者又称为活体式NETs[6]，NETs 可自发产生，一般只耗时5～60 min，不依赖NADPH 氧化酶及诱导产生的ROS，但需要Toll 样受体（Tolllike receptor，TLR）或补体受体对相关感染性刺激的识别，同样被激活的PAD4 触发组蛋白瓜氨酸化，致使染色质解聚，被包裹的染色质DNA 以囊泡出芽的方式排出胞外，过程中细胞核膜和细胞膜保持完整，中性粒细胞存活时间及吞噬、趋化等功能均未受影响。

2 NETs参与CRC的发生发展

CRC 是一类高危恶性肿瘤，每年约有190 万新发病例和超过93 万的死亡病例，是全球癌症相关死亡的第二大原因[7]，具有高复发、高转移等特性。尽管目前在CRC 的诊治方面已有较大突破，尤其是新辅助放化疗及免疫治疗领域的快速发展，然而仍有近一半的CRC 患者最终会出现复发或转移，晚期患者5年相对生存率仅为14%[8-9]。故进一步了解CRC 恶化机制，发掘更为有效的潜在治疗靶点是目前亟待解决的问题。近年来研究发现NETs 在胃、肺、肝、乳腺、胰腺等多种恶性肿瘤中异常高表达[10-13]，且NETs 异常程度与肿瘤进展、患者预后密切相关。大量研究结果提示，NETs 及其组分可通过系列途径促进CRC 的发生和发展。

2013年，Berger-Achituv 等[14]首次在尤文肉瘤中检测发现NETs，并发现NETs 在肿瘤组织中高表达并与患者的不良预后有关，Yang 等[15]通过与健康个体对比发现CRC 患者体内NETs 水平也呈显著性升高，且NETs 水平与肿瘤复发及术后并发症的发生呈正相关。Yazdani 等[16]对27 例CRC 肝转移患者行组织病理学研究发现肿瘤组织中性粒细胞和NETs 水平显著增加，且瓜氨酸化组蛋白3（citrullinated histone 3，CitH3） 和MPO DNA 水平也呈一致性升高，而NETs 与其组分的升高也被证实和患者预后不良相关。除此之外，中性粒细胞及其NETs 在肿瘤组织上的密度和分布也存在显著差异，Arelaki 等[17]分析10 例CRC 患者的肿瘤组织和淋巴结转移组织发现NETs 数量从肿瘤中心到边缘组织逐渐减少，这反映了肿瘤病变引发并逐渐扩散到周围组织的炎症梯度，可为外科医师对手术切缘的选择提供一定的帮助。NETs 可参与肿瘤诱导的全身效应，同时肿瘤细胞及肿瘤相关微环境（tumor microenvironment，TME）也可以通过多种方式促进NETs 的形成。在CRC 组织和腺瘤、增生性息肉等癌前病变组织中，检测到共表达多聚磷酸盐（polyphosphate，polyP） 和CD68+的肥大细胞和NETs 的形成，polyP 主要由血小板释放，可介导炎症反应促进血栓的形成，而在本研究中表达CD68+的肥大细胞可以通过polyP 与中性粒细胞发生相互作用，进而诱导NETs 的产生[18]。另外，肿瘤细胞还可产生大量的趋化因子IL-8 诱发NETs 的形成并促进癌症的进展[19]，其中CXC 趋化因子受体（CXC chemokine receptor，CXCR）是其形成过程中的重要媒介[20]，在CRC 的不同阶段中也观察到血清IL-8 及CXCR2 的表达水平均较正常组显著升高[15]。另有研究人员[21]在弥漫大B 细胞淋巴瘤中证实，IL-8 与中性粒细胞上的CXCR2 相结合，通过激活Src、p38 及ERK 信号通路而加速NETs 的产生。Shang 等[22]发现CRC 中突变的致癌基因KRAS可通过外泌体将其转移至中性粒细胞，进而触发IL-8 的上调而引起NETs 的形成。此外，Wang 等[23]在经脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 刺激后的CRC 小鼠模型中发现，CRC 细胞可通过Toll 样受体9 （Toll-like receptor 9，TLR9） 和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路介导NETs 的形成。以上可见，NETs 在CRC中高表达，且CRC 细胞及其微环境可通过多种途径调节NETs 的形成。

Yazdani 等[16]证实活化的CRC 细胞能够释放损伤相关分子模式 （damage associated molecular pattern，DAMP） 蛋白，可将中性粒细胞募集到TME 中并诱导NETs 形成，NETs 则可通过增强线粒体的生物合成，加速CRC 细胞的生长和增殖，其具体机制为NETs 释放NE 激活癌细胞上的Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4），通过p38 通路引起与能量代谢相关的转录共激活因子PGC-1α 的表达增加，进而调控线粒体的生物合成，增加能量产生而加速肿瘤的生长。在小鼠模型中阻止NETs的形成可观察到CRC 的生长速度明显减缓。此外，有研究[24]发现NETs 来源的DNA 可与晚期糖基化终末产物受体RAGE 相结合，通过激活胰腺星状细胞使纤维化基质形成增加，促进胰腺肿瘤的生长和增殖。Albrengues 等[25]还发现机体炎症状态诱导产生的NETs 可激活休眠期的乳腺癌细胞，使其进入G1期并开始增殖。研究人员在小鼠乳腺癌[26]及胰腺癌[24]模型中通过敲除PAD4 而抑制NETs 形成后，发现其肿瘤生长速度明显降低。以上可见，NETs的产生与肿瘤的生长和增殖密切相关，除此之外，NETs 亦可通过捕获循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、诱导侵袭、促进血管生成、逃避免疫等系列途径引起CRC 的转移和扩散。

对CRC 患者的组织样本的免疫染色显示，原发肿瘤组织及转移淋巴结中均存在NETs[17]。Yang等[15]还发现无论CRC 是否发生转移，其原发灶的NETs 水平并没有显著差异，而通过对CRC 的肝转移灶和原发性肝细胞癌组织对比发现，转移性肝肿瘤中的NETs 数量明显高于原发性肝肿瘤，表明NETs 与CRC 患者肝转移的发生密切相关，NETs 可能在即将转移的靶器官中发挥更重要的作用以促进肿瘤转移的发生。在CRC 中广泛形成的NETs 可捕获CTC，并使其黏附于肺和肝脏等相应靶器官而促成转移，通过多种措施消耗或抑制NETs 的形成，可发现其侵袭转移能力明显下降，证实靶向治疗NETs 可有效限制肿瘤转移。肝脏是CRC 发生转移最主要的靶器官，目前手术切除肝转移灶仍是CRC 转移患者有效且可能获得长期生存的唯一治疗方法[27]，但患者极易在术后出现复发[28]。Tohme 等[29]报道肝切除术可能会导致肿瘤细胞脱落，使CTC 水平升高，另外，手术应激可诱导肝脏发生缺血再灌注损伤，使NETs 在肝脏内大量沉积，NETs 通过加强CTC 的黏附能力来促进肿瘤细胞 的 播 散 ，使 用 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 I（deoxyribonuclease I，DNase I）或PAD4 抑制剂抑制NETs 的形成可有效减缓这一进程，进一步在体外研究中发现NETs 是通过释放高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1），从而激活癌细胞中的TLR9 信号通路发挥其促瘤作用。Carroll 等[30]也证明CRC 术后相关的全身性炎症反应或脓毒症可诱导释放NETs 而增加肿瘤复发的风险。另外Rayes 等[31]发现在非炎症和感染情况下，原发性的CRC 细胞也可诱发NETs 捕获CTC 并促进其黏附和转移。最新研究[32]表明细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）是NETs 诱导CRC 细胞迁移的重要调节因子，NETosis 过程中释放的NE 通过激活ERK 发挥促瘤作用，在小鼠模型中使用西维来司他抑制NE 可有效减少CRC 转移灶的形成。Rayes 等[33]发现NETs 上的癌胚抗原细胞黏附分子1（carcino-embryonic antigen related cellular adhesion molecule 1，CEACAM1）也是介导CRC 细胞与NETs 相互作用的重要黏附分子，并在小鼠CRC 细胞与肝脏的黏附中起关键作用。此外，NETs 并非随机捕获CTC，而是可能与癌细胞表面的某种蛋白产生了特异性结合，且这种结合对于NETs 促进CRC 转移至关重要，Yang 等[34]通过研究证明癌细胞表面存在一种跨膜蛋白CCDC25，可有效感知NETs DNA 并通过CCDC25 胞外的AA21-25 区域与NETs DNA 高特异性结合，进而触发ILK-β-parvin-RAC1-CDC42 级联反应，以诱导CRC 肿瘤细胞的骨架重排和定向迁移，因此，靶向CCDC25 也为早期癌症转移提供治疗策略。

上皮- 间质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，最新研究[35]发现用NETs 处理CRC 细胞可诱导形成丝状伪足和重组细胞骨架等EMT 表型，并可观察到上皮细胞标志物cytokeratins 和E-cadherin 缺失，间充质细胞标志物波形蛋白、纤连蛋白、ZEB1 和Slug 的表达上调，以上表明NETs 激活了CRC 细胞的EMT过程，进而促进CRC 细胞的转移。血管生成也是恶性肿瘤完成生长和转移的关键步骤和必备条件，而NETs 上的CG、MMP-9 等多种成分可激活血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）或通过产生IL-8、IL-6 等直接刺激来调节肿瘤组织的血管生成[36-37]，为肿瘤的转移过程提供丰富的血供。除此之外，肿瘤细胞在转移过程还会不断受到免疫系统的监视和攻击，促使肿瘤细胞发生免疫逃逸同样是肿瘤细胞转移和扩散的关键，研究[20]发现NETs 在TME 中具有免疫抑制作用，可排斥细胞毒性细胞并吸引调节T 细胞及骨髓细胞等免疫抑制细胞。NETs 还可包裹肿瘤细胞，作为免疫细胞和周围靶细胞之间的物理屏障，使其免受CD8+T 细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞介导的细胞毒性损害。

3 NETs参与CRC相关性血栓形成

肿瘤相关性血栓形成是肿瘤患者的第二大直接死亡原因[38]，仅次于肿瘤本身，是肿瘤患者的预后不良的关键。肿瘤相关性血栓栓塞包括静脉血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE） 和动脉血栓栓塞（arterial thromboembolism，ATE），其中恶性肿瘤患者的VTE 发生率是普通人群的9 倍[39]，CRC 患者更是罹患静脉血栓的高危人群[40]，然而其确切机制仍不清晰。研究发现NETs 可以通过多种途径诱导肿瘤患者血管内血栓前状态以及血栓形成[41-42]，一方面，NETs 作为大分子复合物，其网状支架结构可为血小板及纤维蛋白的黏附和沉积提供良好的附着点。另一方面，NETs 中的NE 和CG 等成分可激活内源性凝血途径进而促进凝血及血栓形成[43]。最重要的是，NETs 可通过捕捉和激活血小板，促使其发展为促凝血表型，加速血栓的形成[44]。Zhang 等[45]对60 例CRC 患者和20 名健康人对照发现，CRC 患者更易产生NETs，并与癌症进展相关，经PMA 刺激后，NETs 还可显著增加其促凝血活性（procoagulant activity，PCA），表现为凝血时间缩短，凝血酶-抗凝血酶复合物和纤维蛋白原显著增加，NETs 可诱导血小板和人脐静脉内皮细胞 （human umbilical vein endothelial cells，HUVECs） 膜 上 的 磷 脂 酰 丝 氨 酸（phosphatidylserine，PS）位点暴露，这种具有促凝活性的负电磷脂为凝血因子提供了促凝表面，使得凝血因子易于互相接触和组装，有效提升PCA。此外，活化的血小板也能诱导NETs 的产生，从而与中性粒细胞形成正反馈的环路。上述研究揭示了中性粒细胞、血小板和内皮细胞之间的复杂关系，以及它们在CRC 高凝状态中的潜在作用。相信随着对NETs 临床研究的不断深入，NETs 可能成为防治CRC 相关血栓形成的一个新靶点。

4 NETs是CRC治疗潜在靶标

NETs 在CRC 中高表达对其疾病的发生和发展有重要的推动作用，故能否将NETs 作为CRC 中潜在的生物标记物和治疗靶点也逐渐成为目前的研究热点。Zhang 等[46]对比不同患者的NETs 水平发现NETs 比癌胚抗原CEA 和碳水化合物抗原19-9 更具诊断价值，此外，多项临床预后评估证明NETs 可作为一项独立的肿瘤相关预后指标[47-48]，NETs 高表达与总生存率（overall survival，OS）和无复发生存率（relapse-free survival，RFS） 降低相关[49]。CitH3 作为NETs 的核心分子，被认为是预测晚期癌症患者VTE 风险和病死率的潜在诊断和预后生物标志物[50-52]。最近一项研究[53]采用多重免疫荧光法，将CitH3 与中性粒细胞标记物CD15 和MPO 相联合，用于检测CRC 等实体肿瘤中的NETs。Li等[54]还研发了一种结合CitH3 与DNA 的新型NETs定量检测方法。能够高效、准确的识别NETs 对于肿瘤的早期筛查和病情监测具有重要意义，但NETs 的检测尚未标准化，且NETs 可能缺乏用于诊断某一特定肿瘤类型的特异性，故其临床应用还有待进一步验证。

抑制NETs 形成进而减缓CRC 进展是目前CRC治疗领域极具潜力的研究方向。DNase I 是一种可以消化单链或双链DNA 的非特异性核酸内切酶，大量研究发现DNase I 可通过降解NETs 的DNA 骨架破坏其结构完整性，进而发挥抗肿瘤活性，且不影响中性粒细胞的正常生理功能[55]，目前DNase I已被FDA 批准用于囊性纤维化患者的治疗[56]，但DNase I 蛋白的半衰期相对较短，往往需要长期重复给药，其临床应用也受到限制。Xia 等[57]发现通过AAV 介导的DNase I 基因转导肝脏可有效抑制CRC 肝转移小鼠模型中中性粒细胞的浸润和NETs的形成，还可招募CD8+T 细胞并调节固有和适应性免疫应答机制诱导抗肿瘤免疫，有效抑制CRC 肝转移。Zhang 等[58]报道DNase I 还可与免疫检查点抑制剂PD-1 联合应用，通过改善肿瘤微环境有效提升PD-1 对CRC 的治疗效果。因此，针对NETs 形成的任一重要环节都可能成为其潜在的CRC 治疗靶点，PAD4 是NETosis 的关键酶，也是阻断NETs 病理作用的重要靶点[59]。目前较为典型的PAD 抑制剂包括不可逆性抑制剂Cl-amidine 和可逆性抑制剂GSK-484[60-61]，并在相关临床研究前研究中表现出和敲除PAD4 基因相似的抗肿瘤效应。此外，通过抑制Ne[62]、ROS[63]、NO/NOS[64]等基因或蛋白表达都可抑制NETs 形成。针对各类靶向NETs 药物的研究正在如火如荼的开展，有研究[65]发现茶多酚中重要的活性成分表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG） 可通过调控STAT3/CXCL8 信号通路抑制NETs 的形成，进而抑制CRC 的侵袭与迁移。Zhu 等[66]证明姜黄素可通过下调MEK/ERK 信号通路抑制NETs 而缓解肝脏缺血再灌注损伤，将姜黄素与DNase 1 联合使用可有效提升其药物疗效。Zeng 等[67]研究表明山奈酚通过影响ROS-PAD4 途径靶向抑制NETs 减少肿瘤的转移。此外，NETs 相关的CEACAM1 和癌细胞表面的跨膜蛋白CCDC25 作为CRC 肿瘤转移潜在的治疗靶标，有希望带来一种全新的抗癌疗法。

5 展 望

在相关临床试验中应用DNase I 或PAD4 抑制剂等药物，能够有效阻止NETs 的形成进而抑制癌细胞进展，提示靶向抑制NETs 有望为CRC 的防治和联合用药提供新的思路和选择。NETs 作为免疫系统的一部分，抑制NETs 的同时应避免损害其正常的生理功能。基于此，肿瘤NETs 临床与基础研究还有待开展深入的研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：贾栋和陈顺负责收集文献资料和撰写论文；解有成、康殷楠、赵宝银负责文章写作思路；仵朝晖、王俊科、于晓辉指导写作和定稿。