硫化物自养反硝化运行效能分析及响应曲面优化

尹思婕，李再兴，高 玮，刘晓帅，张妙雨，刘艳芳

（1.河北科技大学环境科学与工程学院，河北石家庄 050018；2.北京石油化工学院环境工程系，北京 102617；3.河北科技大学建筑工程学院，河北石家庄 050018；4.河北圣雪大成制药有限责任公司，河北石家庄 051430）

在垃圾填埋、制药和采矿行业会产生大量含有硫化物（S2-）和氮元素的废水〔1〕，在偏酸性环境下输送时会造成管道腐蚀增加维护成本，此外，利用厌氧工艺处理此类废水时，S2-会通过扩散进入微生物细胞内部，使细胞内蛋白质变性〔2-3〕、细胞色素失活〔4〕，引起颗粒污泥破碎，出水水质变差。同时水中过量的氮元素是造成水体富营养化的主要原因之一，水体富营养化会使藻类大量繁殖引起水中溶解氧降低，从而危害水中动植物的生存〔5〕。

近年来，以S2-为电子供体的自养反硝化工艺因能同时去除水中硝酸盐（NO3-）和S2-〔6〕而受到广泛关注。硫化物自养反硝化是自养微生物在缺氧或厌氧条件下，以S2-为电子供体，NO3-为电子受体，将其还原为N2的过程〔7〕。反应过程中以无机碳（CO2、CO32-和HCO3-）为碳源，与传统活性污泥法相比，可减少约70%的污泥产量、30%的能耗和30%的温室气体排放量，实现高效低成本脱氮，并且最终产物为硫酸盐（SO42-）/单质硫（S0）和N2〔8〕，对环境无害。

水中NO3-与S2-物质的量比值（记作nN/nS）对硫化物自养反硝化工艺的脱氮效率至关重要。目前相关研究多集中于通过控制进水nN/nS，使硫化物自养反硝化过程控制在短程反硝化阶段，为厌氧氨氧化工艺提供尽可能多的亚硝氮（NO2-）。研究表明，在nN/nS为1.25 时，NO2-的积累率可达到55.3%〔9〕，而当进水nN/nS为0.8～0.9 时，NO3-和S2-可被完全去除〔10〕。目前有关硫化物自养反硝化最佳温度、pH 的报道较少，缺乏系统化的研究，为更好了解硫化物自养反硝化制约因素，设计考察硫化物自养反硝化最佳进水nN/nS、温度和pH。

本研究采用硫化物自养反硝化脱除水体中的总氮（TN）和S2-，通过单因素实验，确定硫化物自养反硝化影响因素的取值范围；采用响应面法（RSM）设计批次实验，对硫化物自养反硝化工艺的TN 去除性能进行评价和优化；在此基础上，构建升流式硫化物自养反硝化脱氮动态流系统，通过对出水TN、NO3--N、NO2--N、SO42-及S2-的测定，考察硫化物自养反硝化的脱氮效能；并通过高通量测序对微生物群落进行鉴定，以更好地探究微生物群落的变化，为实际工程应用提供数据参考。

1 实验材料及方法

1.1 实验材料

实验中所用污泥取自实验室课题组前期驯化的高效自养反硝化菌泥，MLSS 为30 g/L，MLVSS 为10.2 g/L，对污泥16S rRNA V3～V4 扩增区域的微生物进行分类测序分析，其微生物群落丰度如图1 所示，优势菌属为Thiobacillus（硫杆菌属）。

图1 污泥在属分类水平上的微生物群落分布Fig.1 Microbial community distribution of sludge at genus classification level

1.2 实验内容

1.2.1 静态批次实验

静态实验过程由两个阶段组成。第一阶段为单因素实验，考察不同pH、温度及nN/nS对TN 去除率的影响，通过单因素实验，初步确定工艺参数范围；第二阶段是在第一阶段的基础上，采用Design-Expert软件设计响应曲面优化实验，根据Box-Behnken Design（BBD）模型设计三因素三水平实验，进一步优化工艺条件。

以500 mL 厌氧瓶为反应器，每个瓶内加10 mL驯化污泥，400 mL 模拟废水，模拟废水由一定量的KNO3（NO3--N 为50 mg/L）、Na2S·9H2O、KH2PO4和NaHCO3组成。采用N2鼓吹10 min 以营造微生物适宜生长的缺氧环境，用丁基橡胶塞封住瓶口保持缺氧环境。pH 通过1.5 mmol/L 的NaOH 或者1.5 mmol/L的H3PO4控制。实验是在水浴锅内进行，水浴锅转速为120 r/min，每组实验设置两个平行实验，反应48 h 后取10 mL 水样过0.45 µm 滤膜测定TN。

1.2.2 动态运行实验

构建升流式固定床硫化物自养反硝化动态反应系统，见图2。

图2 反应器装置示意Fig.2 Device diagram of the reactor

如图2 所示，反应柱高30 cm，内径9 cm，壁厚0.5 cm，材质为有机玻璃。反应柱内填料为轻质陶粒，表观呈球形，粒径为5～6 mm，填料填充高度为20 cm。为均匀布水，在反应器底部装填3 cm 厚的鹅卵石。为提高反应器脱氮稳定性，接种污泥为1.1 章节实验材料中的驯化污泥。实验进水为模拟废水，其组分为0.216 6 g/L KNO3、0.686 3 g/L Na2S·9H2O、0.216 6 g/L KH2PO4、0.259 9 g/L NaHCO3。水力停留时间（HRT）为5 h，pH、温度、nN/nS控制在响应曲面优化得到的最佳工艺条件，对硫化物自养反硝化动态流的脱氮效果进行探究。

1.3 分析方法

1.3.1 水质指标分析

按照《水和废水监测分析方法（第4 版）》对进出水水质进行分析。NO3--N 采用紫外分光光度法，NO2--N 采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法，TN采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法，pH 测定采用玻璃电极法（pHS-2F），SO42-采用铬酸钡分光光度法，S2-采用对氨基二甲基苯胺光度法（亚甲蓝法）。

1.3.2 微生物样品分析

为进一步了解S2-为电子供体的自养反硝化脱氮效能，对比分析动态硫化物自养反硝化系统反应前后微生物群落结构。分别取反应器运行前的污泥（标记样品编号为X），反应器上部、中部、下部（标记样品编号为X1、X2、X3）污泥样品，对其进行16S rRNA 高通量测序，扩增引物为338F（5’-ACTCCTACGGGAGGC AGCAG-3’）、806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3’）。该测试委托上海美吉生物医药科技有限公司测定。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 初始pH 对TN 去除效果的影响

在温度为30 ℃、nN/nS为0.4 的条件下，探究初始pH 对TN 去除效果的影响，结果见图3。

图3 初始pH 对TN 去除效果的影响Fig.3 Effect of initial pH on TN removal efficiency

由图3 可知，在初始pH 6.5～9.0 内，随着初始pH 的增大，TN 去除率呈先升高后降低的趋势，原因是作为生物驱动的反应进程，pH 的改变会引起菌体酶蛋白的带电状态发生变化〔11〕，从而影响对TN 的去除效果。当pH 为7.0 时，TN 的去除率达到峰值，为84.62%。牛建敏等〔12〕分离得到的脱氮硫杆菌T.denitrificans最佳反硝化pH 为7.04，与本实验结果近似。当pH 升高至9.0 时，TN 去除率仅为39.29%，较最佳pH 为7.0 时下降了45.33%，这是由于高pH会抑制亚硝酸盐还原酶的活性〔13〕，影响反硝化进程。

2.1.2 温度对TN 去除效果的影响

在pH 为7.0、nN/nS为0.4 的条件下，探究温度对TN 去除效果的影响，结果见图4。

图4 温度对TN 去除效果的影响Fig.4 Effect of temperature on TN removal efficiency

由图4 可知，硫化物自养反硝化最佳反应温度为30 ℃，TN 去除率可达到83.84%，这是由于硫自养反硝化菌大多属于嗜中温菌〔14〕，温度过高或过低都会使硫化物自养反硝化速率降低，Yaxian XU 等〔15〕研究表明在进水NO3--N 为50 mg/L，温度为30 ℃时完全反硝化所需时间最短，仅需2.5 d，这与本实验得出的最佳温度一致。在温度为20 ℃时，TN 去除率为53.46%，而当温度升高至40 ℃时，TN 去除率为71.33%，与30 ℃相比都有所降低，低温环境会抑制硝酸盐还原酶，高温则会对亚硝酸盐还原酶造成影响〔16〕。在其他温度下想要达到相同的脱氮效果需延长HRT。

2.1.3nN/nS对TN 去除效果的影响

在pH 为7.0、温度为30 ℃的条件下，探究nN/nS对TN 去除效果的影响，结果见图5。

图5 nN/nS对TN 去除效果的影响Fig.5 Effect of nN/nS on TN removal efficiency

由图5 可知，当nN/nS为0.7 时，对TN 去除率最高，为91.78%；当nN/nS大于0.7 时，即S2-相对减少时，TN 去除率呈下降趋势；在nN/nS为1.6 时，TN 去除率仅为48.33%，主要原因是S2-不足会导致反应系统NO2-积累过高。Yujie QIN 等〔17〕控制硫化物自养反硝化过程进水nN/nS大于0.96，提高系统NO2-积累量，为后续厌氧氨氧化工艺提供电子受体。而当nN/nS为0.4 时，TN 去除率为80.94%，即进水S2-浓度的增加时并未带来TN 去除率的提升，这可能由于过高的S2-浓度会对微生物产生毒害作用，Hui LU 等〔18〕研究结果表明当S2-质量浓度大于200 mg/L 时，会抑制硝酸盐还原酶，硝酸盐还原阶段成为硫自养反硝化脱氮过程中的主要限制步骤。

2.2 响应曲面法优化

2.2.1 模型建立及方差分析

根据单因素实验结果，以pH、温度和nN/nS为自变量，分别用A、B、C表示，进行工艺参数响应曲面法优化。以BBD 为模型设计的响应曲面实验方案及结果见表1。

表1 响应曲面实验设计与结果Table 1 Experimental design and results of RSM

通过Design-Expert 软件对表1 的实验数据进行分析，得到TN 去除率的多元二次回归方程模型为：TN 去除率=92.83+1.57A+9.00B+9.47C+2.74AB+5.06AC-0.24BC-20.27A2-11.64B2-19.97C2。对该模型方程进行方差分析，结果见表2。

由表2 可知，模型的F为36.83，且P＜0.000 1， 说明该回归模型差异极显著；模型的信噪比为16.398，大于5，表明模型的真实度高；模型的失拟项P为0.124 4，大于0.05，不显著，说明该模型的拟合度好，接近真实情况；模型的决定系数（R2）=0.979 3，校正系数（Radj2）＝0.952 7，表明该模型可以解释95.27%的响应量变化，实验误差小；模型的变异系数（CV）越小，模型的可信度越高，该模型的CV 为6.18%，小于10%，说明本实验得到的模型可信度高。由自变量的F可得出，不同因素对TN 去除率影响次序为：nN/nS（C）＞温度（B）＞初始pH（A）。

2.2.2 响应曲面分析

为更清楚地分析初始pH、温度、nN/nS两两交互作用对TN 去除率的影响，通过Design-Expert 软件绘制三维响应曲面及等高线，如图6 所示。

图6 （a）可知，当nN/nS一定时，TN 去除率随着温度和pH 的增加呈先升高后降低的趋势，响应曲面坡度比较平缓，同时结合表2 的结果，交互项AB的P为0.235 9，大于0.05，表明AB之间的相互作用不显著；由图6（b）可看出，等高线形状接近圆形，也表明AB相互作用不显著。

由图6（c）可知，当温度一定时，TN 去除率随着pH 和nN/nS的增加呈先升高后降低的趋势，响应曲面坡度比较陡峭，同时结合表2 的结果，交互项AC的P为0.048 0，小于0.05，表明AC之间的相互作用显著；从图6（d）可看出，等高线形状接近椭圆形，也表明AC相互作用显著。

由图6（e）可知，当pH 一定时，TN 去除率随着温度和nN/nS的增加呈先升高后降低的趋势，响应曲面坡度比较平缓，同时结合表2 的结果，交互项BC的P为0.912 9，大于0.05，表明BC之间的相互作用不显著；从图6（f）可看出，等高线形状接近圆形，也表明BC相互作用不显著。

2.2.3 最优反应条件的验证

利用Design-Expert 软件对实验条件进行预测，得出的最优反应条件：pH=7.05、温度31.98 ℃、nN/nS=0.75，TN 去除率为95.85%。为了考察模型的准确性，在模型预测的最优条件下进行了3 次重复实验，测得TN 去除率的平均值为95.53%，实验结果与预测值相差0.32%，与模拟预测结果基本相同，这说明响应曲面法模拟得到的最优反应条件准确可靠。故确定硫化物自养反硝化系统最佳运行条件为pH=7.05、温度31.98 ℃、nN/nS=0.75。

2.3 硫化物自养反硝化动态流系统脱氮性能研究

在最佳条件下，设置HRT 为5 h，进行硫化物自养反硝化动态流实验，考察系统运行期间NO3--N、NO2--N、TN、pH、S2-、SO42-变化情况。

2.3.1 氮元素的变化

硫化物自养反硝化动态流运行期间，NO3--N、NO2--N 及TN 随时间变化如图7 所示。

图7 系统运行期间氮元素变化情况Fig.7 Nitrogen changes during the system operation

由图7（a）可知，运行全程中NO3--N 去除率在81.54%～97.60%之间波动，运行前7 d 出水NO2--N一直维持在较高水平，最高积累量为3.17 mg/L，之后出水NO2--N 迅速降低并基本稳定，可能因为前期微生物对动态流实验运行需要一定的适应期。马潇然等〔19〕通过搭建SBR 反应器进行硫自养反硝化，反应前期也有类似现象，NO2--N 积累较高。运行过程中，NH4+-N 一直低于检出限，表明并未发生NO3-异化还原为铵的反应〔20〕，反硝化的最终主要产物为N2。运行后10 d 系统可稳定运行，由图7（b）可知，后10 d 系统TN 去除率基本保持不变，维持在92.79%～94.31%。

2.3.2 pH 的变化

硫化物自养反硝化动态流运行期间，pH 随时间变化见图8。

图8 系统运行期间pH 变化情况Fig.8 pH changes during the system operation

如图8 所示，在运行过程中，与S0自养反硝化过程产生H+不同〔21〕，反应器出水pH 较进水有所升高，最大增加量为1.2，这可能与硫化物自养反硝化过程产生碱度有关。Yue SUN 等〔22〕在研究进水S2-浓度对硫化物自养反硝化过程的影响时发现，碱度随进水S2-底物浓度增加而增加，引起出水pH 升高。

2.3.3 SO42-的变化

反应过程中进水S2-和出水SO42-的质量浓度变化如图9 所示。

图9 系统运行期间S2-、SO42-变化情况Fig.9 S2-、SO42- changes during the system operation

由图9 可知，出水SO42-质量浓度呈波动升高的趋势，运行前10 d 出水的SO42-平均质量浓度为184.46 mg/L，后10 d 出水的SO42-平均质量浓度升高至200.17 mg/L。出水S2-质量浓度低于检出限，整个反应期间难以达到进出水硫平衡，可能是由于S0和其他中间硫化合物的形成。在运行过程中观察到反应器内壁黏附着被小气泡包围的乳白色物质，推测为S0的形成和积累。一般来说S2-的生物氧化可分为2 个步骤〔23〕：1）S2-→S0；2）S0→SO42-。第2 步的速率相对较低。高S2-浓度（nN/nS＜1.6）会导致部分电子供体的氧化，加速形成硫的中间产物〔24〕，过量的S2-促进了其向S0的转化。

2.4 微生物群落结构分析

2.4.1 SEM 分析

为清楚观察填料表面的污泥挂膜生长情况，取反应器内中部位置填料进行电镜扫描，图10（a）为填料表面放大5 000 倍的SEM，图10（b）为填料表面放大20 000 倍的SEM。

图10 填料表层的SEMFig.10 SEM of packing surface

从图10 可以看出，填料表面附着大量的杆状细菌，其表面光滑，边缘清晰，大小约为（0.2～0.4） µm×（0.6～2） µm，这与赵晴等〔25〕所述硫化物自养反硝化优势功能菌的形态具有一致性。轻质陶粒粗糙多孔，不仅可加快固-液相传质速率，还有利于产生的N2从孔隙排出，可见轻质陶粒填料为硫化物自养反硝化菌生长提供附着点是可行的。

2.4.2 微生物菌群特征

分别取反应器上部、中部、下部污泥样品X1、X2、X3，对其进行16S rRNA 高通量测序，其微生物群落分析见图11。

由图11（a）可知，在门水平上，X1、X2、X3 样品中主要优势菌门基本一致，均为Proteobacteria，其相对丰度占比分别为53.03%、54.20%、56.46%，Proteobacteria 是细菌中最大的一个菌门，包含各类的硫化物氧化细菌和反硝化细菌。

由图11（b）可知，在属水平上，Thiobacillus是反应系统中的优势菌属。该菌是一种典型的硫氧化-硝酸盐还原菌属〔26〕，在反应器下部相对丰度占比最高，为49.99%，中部和上部相差不大，相对丰度占比分别为46.31%和46.39%，随高度增加其相对丰度略有降低，这可能是由于硝酸盐、硫化物等营养物质在反应的进程中不断减少，而高浓度的营养物质对Thiobacillus的生长繁殖有促进作用。另外，有研究表明，Sulfurovum菌属下的部分菌种也可将S2-作为电子供体，使NO3-还原为N2，在硫化物自养反硝化过程中起着重要作用〔27〕，其相对丰度占比与HRT 长短有一定联系〔28〕，在本反应器上中下部的相对丰度占比分别5.43%、4.88%和5.77%。

3 结论

1）通过批次实验、采用响应曲面法，得到硫化物自养反硝化工艺最佳运行参数为初始pH=7.05、温度31.98 ℃、nN/nS=0.75，对脱氮效率的影响由大到小为：nN/nS＞温度＞初始pH，其中初始pH 和nN/nS之间的相互作用显著。

2）在最佳参数下进行硫化物自养反硝化工艺脱氮效能研究，当进水TN 为30 mg/L，HRT 为5 h 时，10 d 后运行稳定，TN 去除率最高为94.31%，可实现深度脱氮。

3）反应器上中下部污泥优势菌属均为典型的硫自养反硝化功能菌Thiobacillus，相对丰度占比分别为46.39%、46.31%和49.99%。