超声波辅助醇提法提取栀子中栀子黄色素

陈莎莎 曹如涛 林继辉

摘要：提高梔子果中栀子黄色素的提取率对后期栀子黄色素的精制及应用具有积极促进作用。该研究旨在建立一种从栀子果实中提取栀子黄色素的有效经济方法。通过超声辅助法研究栀子果实中粒度、提取时间、提取温度、提取剂浓度及液料比对栀子黄色素提取率的影响，基于单因素实验结果，采用五因素三水平的响应面法优化提取工艺，以提高栀子黄色素的提取率。结果显示，栀子黄色素的最佳提取工艺是提取时间31 min、提取温度62 ℃、液料比25∶1、乙醇浓度48%、粒度80目。采用响应面法优化后的提取工艺，栀子黄色素实际平均提取率为18.36%，与响应预测值18.38%相差0.02%，误差为0.19%，误差较小，说明该工艺具有良好的可靠性。与单因素实验相比，优化后的提取工艺将栀子黄色素的提取率从15.15%提高到18.36%，故优化后的工艺有利于栀子黄色素的提取，具有实际应用价值。

关键词：栀子果；栀子黄色素；超声波；响应面法；优化

中图分类号：TS202.3      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）12-0180-08

Extraction of Gardenia Yellow Pigment from Gardenia

by Ultrasonic-Assisted Ethanol Extraction Method

CHEN Sha-sha， CAO Ru-tao， LIN Ji-hui

（School of Life Sciences and Chemistry， Minnan Science and Technology

College， Nan'an 362332， China）

Abstract： Improving the extraction rate of gardenia yellow pigment from gardenia fruit has a positive effect on the purification and application of gardenia yellow pigment in the later stage. This study aims to establish an effective and economic method for extracting gardenia yellow pigment from gardenia fruit. Ultrasonic-assisted method is used to study the effects of particle size， extraction time， extraction temperature， concentration of extractant  and liquid-solid ratio on the extraction rate of gardenia yellow pigment. Based on the results of single factor experiment， the response surface method of five factors and three levels is used to optimize the extraction process， so as to improve the extraction rate of gardenia yellow pigment. The results show that the optimal extraction process of gardenia yellow pigment is extraction time of 31 min， extraction temperature of 62 ℃， liquid-solid ratio of 25∶1， ethanol concentration of 48% and particle size of 80 mesh. By using the extraction process optimized by response surface method， the actual average extraction rate of gardenia yellow pigment is 18.36%， which is 0.02% different from the predicted value of 18.38%， and the error is 0.19%. The error is small， indicating that the process has good reliability. Compared with the single factor experiment， the optimized extraction process increases the extraction rate of gardenia yellow pigment from 15.15% to 18.36%. Therefore， the optimized extraction process is beneficial to the extraction of gardenia yellow pigment and has practical application value.

Key words： gardenia fruit; gardenia yellow pigment; ultrasound; response surface methodology; optimization

栀子属药食同源植物资源[1]。几个世纪以来，栀子果实在亚洲国家一直被用作民间药物。在中国，栀子果是一味传统中药，在中医临床中被广泛用于黄疸、烦恼、失眠和各种与湿热相關的临床症状的治疗[2]。现今栀子在食品和染料工业、医药中都有广泛的应用[3-4]：在食品和染料方面，可用提取的栀子黄色素来合成栀子红色素、栀子蓝色素等；在医药方面，栀子果实既可直接用于生产中成药或调配中药，也可通过提取其活性成分作为药物中间体或实验试剂等。

栀子黄色素被认为是一种具有极高药理价值的天然色素[5]，它的主要组成物质为α-藏花素和藏花酸，在药物研究中被广泛使用[6]，在人体内可以转化为维生素A[7]。研究表明，栀子黄色素具有抗氧化和抑制癌症等作用[8-11]。由于栀子广泛分布于温带地区，故相比于其他国家，我国在原料获取方面优势明显，若将其开发成产品，不但解决了部分地区栀子果滞销的问题，拓宽了农民的销售渠道，而且提升了栀子果的附加值。

用溶剂直接提取活性物质是一种简单的方法，但该方法通常存在提取温度高、萃取时间长等缺点，不仅活性易受损，影响提取率，而且能耗大[12-14]。为了改善这种情况，通常在传统溶剂提取的基础上，辅以微波、超高压或超声波等技术。考虑到超高压设备造价高、成本高，而微波辅助提取容易造成内外温度不均，所以从经济可行及适用于推广生产的角度出发，选择超声辅助醇提法提取栀子果中栀子黄色素，先选取了5个因素来考察其对提取率的影响，然后通过响应面法确定最优提取工艺，旨在建立一种从栀子果实中提取栀子黄色素的有效简便方法，为栀子黄色素在食品、医药、化学等行业中的进一步研究与开发利用提供来源与动力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

江西南昌产栀子果实：购于亳州市沁圆春生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼：上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇、石油醚：西陇化工股份有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

EL104分析天平 梅特勒-托利多公司；DGX-9053鼓风干燥箱 上海南荣实验室设备有限公司；SHB-Ⅲ真空泵 郑州长城科工贸有限公司；HB10旋转蒸发仪 广州仪科实验室技术有限公司；KQ-400E超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；DE-100 g万能高速粉碎机 浙江红景天工贸有限公司；TGL-15B高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；DZF-6021真空干燥机 上海精宏实验设备有限公司；UV-8000紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 原料预处理

取一定量干燥粉碎的栀子果粉末于索氏提取器的套管中，以石油醚作为萃取剂，正常回流萃取除油[15]，再将除完油的栀子粉末烘至恒重，然后筛分为20，40，60，80，100目5种粒径备用。

1.3.2 栀子黄色素的提取

准确称取60目的栀子果粉末0.5 g于圆底烧瓶中，按液料比20∶1（mL/g）加入60%乙醇溶液，温度50 ℃，超声波提取20 min[16-18]，然后抽滤，滤液于旋转蒸发仪中浓缩，最后将浓缩液置于60 ℃的真空干燥箱中干燥，即得栀子黄色素粉末。

1.3.3 栀子黄色素提取率的计算[19]

栀子黄色素提取率=M2/M1×100%。（1）

式中：M1为提取加入的栀子果粉末质量（g）；M2为制得的栀子黄色素粉末质量（g）。

1.3.4 栀子黄色素的检测

取栀子黄色素粉末样品0.100 g，定容至100 mL，用紫外可见光谱仪记录样品在200～800 nm范围内的吸收曲线[19]。因为栀子黄色素的水溶液在238，440，325 nm处有3个特征吸收峰，所以根据所得扫描曲线判断提取出的粉末是否含有所需提取的物质。

1.3.5 栀子黄色素提取的单因素实验设计

考虑到影响栀子黄色素提取率的因素较多，本实验选取了其中5个因素用来考察其对提取率的影响，即粒度、提取时间、提取温度、提取剂浓度（乙醇水溶液）及液料比，并对这5个影响因素分别进行单因素实验，确定影响因素和水平。

按照1.3.2中色素提取方法，将脱脂后的栀子果粉碎过筛，准确称量粒度20，40，60，80，100目的0.5 g栀子果粉末，在提取时间（10，20，30，40，50，60，70 min）、提取温度（30，40，50，60，70 ℃）、液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1）、乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）的条件下，依次进行单因素实验[20]。提取率按公式（1）进行计算。

1.3.6 响应面实验设计

根据各单因素实验结果进行响应面实验设计[21]，见表1。

1.3.7 色价和OD值的检测[22-23]

栀子黄色素的评价标准主要有色价和OD值。根据国标GB 7912－2010，栀子黄色素粉末、膏体以及液体的色价E1%1 cm（440±5）nm≥10。而栀子黄色素绿变的可能性可以通过OD值来衡量，当OD值大于0.5时会使面制品发生绿变。国际市场出口的质量要求在0.2左右甚至更低。色价和OD值的计算公式如下：

E1%1 cm（440±5）nm=A/M。（2）

式中：E1%1 cm（440±5）nm为样品浓度为1%时，用1 cm比色皿在（440±5）nm范围内最大吸收波长处测得的色价；A为在440 nm处溶液的吸光度值；M为100 mL溶液中溶解的样品质量（g）。

OD值=A238 nm/A440 nm。（3）

式中：OD值为被测溶液在238 nm（京尼平苷的吸光度值）与 440 nm（栀子黄色素的吸光度值）的比值。

2 结果与分析

2.1 栀子黄色素的检测

经查文献[19，24]可知，栀子黄色素粗提液在紫外可见光谱下有3个吸收峰，位于440，238，325 nm处，分别对应栀子黄色素、京尼平苷和绿原酸。

由图1可知，本实验提取的栀子黄色素的水溶液在200～600 nm范围内有3个吸收峰，分别在238，325，440 nm处，这与所查的文献中的谱图相符，基本可以确定该提取物中的主要化合物类型，且该实验方法可以将栀子果中的栀子黄色素提取出来。

2.2 单因素实验结果与分析

由图2中a可知，当提取时间在0～30 min时，栀子黄色素的提取率逐渐升高；30 min时提取率达最大，为15.15%；当提取时间超过30 min时，提取率逐渐降低，原因可能是提取时间过长导致色素降解，如氧化或热解而转化成其他化合物[25-26]。由图2中b～d可知，提取率随着提取温度、液料比和乙醇浓度的变化也出现了类似的趋势。当提取温度为60 ℃时，提取率达到最大，为14.86%，可能是合适的温度有利于溶液的传质，但温度过高会导致色素降解[25-26]。当液料比为25∶1时，提取率达到最大值，为14.93%。在液料比超过25∶1后，栀子果中栀子黄色素的提取率呈先降低后升高又降低的趋势，这可能是在液料比为25∶1时，乙醇水溶液对栀子果中的栀子黄色素已经呈现饱和状态，液料比提高并不会使栀子黄色素的提取率增加。当乙醇浓度为50%时，提取率达到最大，随着乙醇浓度的增加，提取率降低，这可能是由于栀子黄色素含有亲水基团，提高乙醇浓度并不能提高提取率，且大多数与栀子黄色素相关的化合物可能具有高极性[27] ，所以低乙醇浓度可以提高提取物的产量。由图2中e可知，栀子粉末越细，栀子黄色素的提取率越高，但粉碎越细所需的粉碎时间及能耗也增加，因此实验选择最佳粒度为80目。

综上，由单因素实验结果确定最佳的提取时间、提取温度、液料比、乙醇浓度和粒度分别为30 min、60 ℃、25∶1、50%和80目。

2.3 响应面实验设计及结果

响应面实验设计及结果见表2。

2.4 残差和方差分析

通过软件Design-Expert 13对表2中的数据进行分析拟合，可以获得残差诊断图、回归模型的方差分析表以及模型的等高线和响应面图。

2.4.1 残差与运行顺序图和残差正态概率图

本实验残差与运行顺序图和残差正态概率图见图3。

由图3中a可知，实验设置的46个点，经过标准化处理后，这些样本的残差都处于－2～2的范围内。通过观察46个实验点的分布情况，可以发现这些样本的分布接近于正态分布，因此可以得出线性模型符合预期，说明模型设计正确[28-29]。通过正态残差图可以评估模型的可靠性，模型残差与随机误差相互偏离的程度越明显，则模型的可靠性越低。由图3中b可知，残差数据点的分布具有正态分布特征，它们沿着一条直线的两边均匀地分布，表明残差符合正态分布的规律，因此，该模型具有很强的可靠性[30]。

2.4.2 响应面回归方程建立及方差分析

对表2中实验数据进行拟合，可得栀子黄色素提取率对提取时间（A）、提取温度（B）、乙醇浓度（C）、粒度（D）、液料比（E）的二次多项式回归模型方程：栀子黄色素提取率=18.31－0.090 6A－0.100 6B－0.030 6C+0.356 9D+0.293 8E－0.097 5AB－0.680 0AC+0.187 5AD+0.502 5AE－0.785 0BC+1.33BD+0.005 0BE－0.142 5CD－0.390 0CE－0.592 5DE－1.04A2－1.21B2－0.854 0C2－0.879 0D2－0.836 5E2。

一般来说，P<0.05表示具有统计学意义。由表3可知，建立的二次回归模型的P<0.01，且F值為134.17，由此说明模型具有极显著性；失拟项的P=0.054 6（P>0.05），失拟项不显著，说明该回归方程对实验的拟合情况较好[29]；同时该模型的校正决定系数RAdj2=0.983 4，说明该模型能较好地拟合真实曲面，且线性回归系数R2=0.990 8，说明该模型的拟合度良好，实验误差较小[31]。由模型的回归效果显著、失拟项不显著以及相关系数说明本次实验使用的提取工艺是可靠的，使用响应面法计算出的提取工艺最优参数是可使用的。由表3中 F值的大小以及回归方程一次项系数可知，5个实验因素对栀子黄色素提取率的影响大小是D（粒度）＞E（液料比）＞B（提取温度）＞A（提取时间）＞C（乙醇浓度）。

2.4.3 响应面立体图分析

通过响应面法可以有效地找到自变量的最佳参数，从而实现响应值最大化。通过观察响应面图可以清晰地了解每个参数的最大值所代表的因素水平，并且可以通过分析投影图中等高线的疏密程度和椭圆形状来推断两个因素之间的相互作用，还可以通过观察图形边缘曲线的陡峭程度来推断它们对栀子黄色素提取率的影响[32]。各因素交互关系对栀子黄色素提取率影响的响应面图见图4。

由图4可知，所有曲面都为凸型面，即各因素在相对应的实验范围内都有相应极值。两个因素之间交互作用极显著的有乙醇浓度与提取时间、粒度与提取时间、液料比与提取时间、乙醇浓度与提取温度、提取温度与粒度、液料比与乙醇浓度、液料比与粒度；交互作用显著的有粒度与乙醇浓度；交互作用不显著的有提取温度与提取时间、液料比与提取温度。各因素的交互作用结果与方差分析结果一致。

利用软件计算回归模型，预测出栀子黄色素的最优提取方案：提取时间为30.76 min，提取温度为62.12 ℃，液料比为25.6∶1，乙醇浓度为48.00%，粒度为86.90目，模型预测的栀子黄色素的提取率为18.38%。

2.5 最佳工艺条件的确定及验证

为了检验优化后的提取工艺的可靠性和精确性，需进行实验验证。由模型预测的栀子黄色素的最佳提取工艺条件组合为提取时间30.76 min、提取温度62.12 ℃、液料比25.6∶1、乙醇浓度48.00%、粒度86.90目。考虑到实际操作的可行性，需对该工艺进行调整修正。

调整修正后的栀子黄色素的提取条件为提取时间31 min、提取温度62 ℃、液料比25∶1、乙醇浓度48%、粒度80目。按照调整修正后的优化条件进行3次平行验证，实验得到的提取率分别为18.33%、18.37%、18.38%，平均值为18.36%，与理论值18.38%相符，同模型预测值的相对误差仅为0.19%。与单因素实验相比，优化后的提取工艺将栀子黄色素的提取率从15.15%提高到18.36%。经过响应面法的优化，建立了一个能够有效提取栀子黄色素最佳工艺条件的回归模型，且模型可靠。

2.6 栀子黄色素评价结果

通过实验1.3.7，得到本实验制得的栀子黄色素色价为77，OD值为1.21。提取出来的栀子黄色素色价达到国家使用要求，但OD值较高，需要通过进一步分离和纯化来降低其绿变的可能性。

3 结论

本实验利用响应面法优化了栀子黄色素的提取工艺，通过实验与分析可得到如下结论：

采用超声辅助醇提取法从栀子果中提取栀子黄色素，在单因素试验基础上得出栀子黄色素提取率的二阶模型：

栀子黄色素的提取率=18.31－0.090 6A－0.100 6B－0.030 6C+0.356 9D+0.293 8E－0.097 5AB－0.680 0AC+0.187 5AD+0.502 5AE－0.785 0BC+1.33BD+0.005 0BE－0.142 5CD－0.390 0CE－0.592 5DE－1.04A2－1.21B2－0.854 0C2－0.879 0D2－0.836 5E2。通过该模型，可以为栀子黄色素提取工艺中各个因素的选择和大小设定提供理论依据。

最佳提取工艺条件为提取时间31 min、提取温度62 ℃、液料比25∶1、乙醇浓度48%、粒度80目。实验证明低温及低乙醇浓度有利于栀子黄色素的提取，可大大降低生产成本。并在此工艺条件下进行3次实验，栀子黄色素提取率为18.36%，与预测值18.38%相差0.02%，误差为0.19%，误差较小，说明优化后的提取工艺参数准确可靠。与单因素实验相比，优化后的提取工艺将栀子黄色素的提取率从15.15%提高到18.36%，故优化后的工艺有利于栀子黄色素的提取，具有实际应用价值。

参考文献：

[1]HAN Y， WEN J， ZHOU T， et al. Chemical fingerprinting of Gardenia jasminoides Ellis by HPLC-DAD-ESI-MS combined with chemometrics methods[J].Food Chemistry，2015，188：648-657.

[2]CHEN L， LI M， YANG Z， et al. Gardenia jasminoides Ellis： ethnopharmacology， phytochemistry， and pharmacological and industrial applications of an important traditional Chinese medicine[J].Journal of Ethnopharmacology，2020，257：112829.

[3]汤丽琴，刘昊澄，温靖，等.栀子黄色素提取、精制及药理活性的研究进展[J].食品工业科技，2022，43（15）：428-435.

[4]GIMNEZ P J， FERNNDEZ-LPEZ J A， ANGOSTO J， et al. Comparative thermal degradation patterns of natural yellow colorants used in foods[J].Plant Foods for Human Nutrition，2015，70：380-387.

[5]CHEN Y， YANG Z L， ZHANG L H， et al. Determination of geniposide， crocin and crocetin in different processing products of fructus gardeniae by HPLC-ELSD[J].Journal of Chinese Medicinal Materials，2011，34（5）：687-690.

[6]CORAN S A， MULAS S， VASCONI A. Profiling of components and validated determination of iridoids in Gardenia jasminoides Ellis fruit by a high-performance-thin-layer-chromatography/mass spectrometry approach[J].Journal of Chromatography A，2014，1325：221-226.

[7]熊英.我國栀子黄色素产业现状和发展趋势[J].现代盐化工，2016，43（4）：15-16.

[8]陈丽萍，王先敏，李茂星，等.栀子中抗氧化的活性成分研究[J].华西药学杂志，2018，33（2）：179-182.

[9]LIU D D， YE Y L， ZHANG J， et al. Distinct pro-apoptotic properties of Zhejiang saffron against human lung cancer via a caspase-8-9-3 cascade[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2014，15（15）：6075-6080.

[10]SEVGI G. Comparative anticancer activity analysis of saffron extracts and a principal component， crocetin for prevention and treatment of human malignancies[J].Journal of Food Science and Technology，2019，56（12）：5435-5443.

[11]LI J， LEI H T， CAO L， et al. Crocin alleviates coronary atherosclerosis via inhibiting lipid synthesis and inducing M2 macrophage polarization[J].International Immunopharmacology，2018，55：120-127.

[12]YANG B， LIU X， GAO Y. Extraction optimization of bioactive compounds （crocin， geniposide and total phenolic compounds） from gardenia （Gardenia jasminoides Ellis） fruits with response surface methodology[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009，10（4）：610-615.

[13]周厚宁，刘超，贺圣文，等.栀子黄色素提取精制工艺的优化[J].山东农业科学，2018，50（9）：134-138.

[14]陈晓明，李开绵，台建祥，等.木薯皮總香豆素活性物质超声波提取工艺优化[J].农业机械报，2012，43（1）：158-164，152.

[15]TANG L Q， LIU H C， HUANG G D， et al.The physicochemical properties and immunomodulatory activities of gardenia yellow pigment from gardenia fruit[J].Journal of Functional Foods，2022，93：105096.

[16]谷勋刚.超声波辅助提取新技术及其分析应用研究[D].合肥：中国科学技术大学，2007.

[17]陆伟，钱骅，张卫明，等.栀子黄色素的提取及精制研究[J].中国食品添加剂，2010，12（1）：77-80.

[18]谢凤霞，邱祖民，涂盛辉，等.提取法与超声波提取法提取栀子黄色素的比较[J].南昌大学学报，2005，29（3）：278-281.

[19]TANG L Q， LIU H C， WEN J， et al. Study on ultrahigh-pressure extraction technology on properties of yellow extract from gardenia fruit[J].Journal of Food Composition & Analysis，2021，104：104186.

[20]高丽，邓青云，姜益泉，等.超声波法提取栀子黄色素的工艺研究[J].安徽农业科学，2012，40（22）：11445-11446.

[21]ZHU X Y， MANG Y L， SHEN F Q， et al.Homogenate extraction of gardenia yellow pigment from Gardenia jasminoides Ellis fruit using response surface methodology[J].Journal of Food Science and Technology，2014，51（8）：1575-1581.

[22]王帆林，武巧，胡娜娜，等.栀子黄色素提取工艺优化及品质评价研究[J].生物化工，2016，2（1）：4-6.

[23]胡军，罗刚华.栀子黄色素的提取与精制工艺研究进展[J].酿酒，2019，46（3）：12-15.

[24]刘建，孟春丽.水提取天然栀子黄色素稳定性研究[J].针织工业，2008（4）：55-57.

[25]BOON C S， MCCLEMENTS D J， WEISS J， et al. Factors influencing the chemical stability of carotenoids in foods[J].Critical Reviews in Food Science & Nutrition，2010，50（6）：515-532.

[26]MANUEL C， AMAYA Z， MAROSARIO S， et al. Generation of saffron volatiles by thermal carotenoid degradation[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（18）：6825-6834.

[27]WU J， ZHANG J T， YU X， et al. Extraction optimization by using response surface methodology and purification of yellow pigment from Gardenia jasminoides var. radicans Makino[J].Food Science & Nutrition，2020，9（2）：822-832.

[28]WEREMFO A， ABASSAH-OPPONG S， ADULLEY F， et al. Response surface methodology as a tool for optimization of the extraction of bioactive compounds from plant sources[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2022，103（1）：26-36.

[29]严文芳，高新华，杨锐铣，等.响应面法优化常压蒸馏提取迷迭香精油工艺[J].中国调味品，2022，47（11）：115-119，124.

[30]贺晓凌，张先楠，孟红艳，等.响应面法优化产细菌纤维素菌发酵条件[J].天津工业大学学报，2020，39（3）：54-60.

[31]胡耀笛，张利，刘松，等.响应曲面法优化感应电芬顿预处理染料废水的运行参数[J].科学技术与工程，2017，17（27）：338-342.

[32]林继辉，陈琳榕，冯庆玲，等.沙棘果总黄酮提取工艺及抗氧化性研究[J/OL].云南民族大学学报（自然科学版）：1-10[2023-02-23].https：//kns.cnki.net/kcms/detail/53.1192.N.20221010.0849.002.html.

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2023.12.030

引文格式：鄭燕菲，韦凤，庞光沃，等.单性木兰叶多糖的超声辅助提取工艺及稳定性研究[J].中国调味品，2023，48（12）：188-192.

ZHENG Y F， WEI F， PANG G W， et al.Study on ultrasonic-assisted extraction technology and stability of polysaccharides from leaves of Magnolia kwangsiensis Figlar & Noot.[J].China Condiment，2023，48（12）：188-192.

收稿日期：2023-06-14

基金项目：福建省教育厅中青年教师教育科研项目（JAT200972）；泉州市高等职业教育技能名师工作室（QZGZS-2019-02）

作者简介：陈莎莎（1988－），女，实验师，研究方向：天然活性物质的提取及分析与检测。