发酵驴乳中酵母菌的分离鉴定及发酵特性研究

刘飞 姜蕾 丁真真 魏健 张甜 吴江超

摘要：酵母菌在乳制品发酵过程中对其风味提升、品质改良有重要作用。为获得具有良好发酵特性的酵母菌株，该研究以喀什地区岳普湖县发酵驴乳为原料，从中分离筛选到9株酵母菌。结合WL培养基菌株形态特征及生理生化实验结果，将9株菌初步鉴别为葡萄汁有孢汉逊酵母、克鲁维毕赤酵母、酿酒酵母和拜尔接合酵母。同种各选一株活性较强的菌株J2、J4、J6、J9，对其耐受性及发酵特性进行研究，得出J6菌株的发酵能力及耐受性较优，以期为发酵驴乳制品的开发提供帮助。

关键词：酵母菌；分离筛选；耐受性；发酵特性

中图分类号：TS201.3      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）12-0075-04

Study on Separation， Identification and Fermentation Characteristics of Yeast in Fermented Donkey Milk

LIU Fei， JIANG Lei， DING Zhen-zhen， WEI Jian， ZHANG Tian， WU Jiang-chao

（College of Life and Geographic Science， Kashi University， Kashi 844006， China）

Abstract： Yeast plays an important role in improving flavor and quality during the fermentation of dairy products.In order to obtain yeast strains with good fermentation characteristics， in this study， with fermented donkey milk in Yopurga County， Kashgar area as the raw material， nine strains of yeast are isolated and screened from it. Based on the morphological characteristics of the strains in WL medium and the results of physiological and biochemical experiments， the nine strains are preliminarily identified as Hanseniaspora uvarum， Pichia kluyveri， Saccharomyces cerevisiae and Zygosaccharomyces. Select J2， J4， J6 and J9， one strain with higher activity from each species， to study their tolerance and fermentation characteristics. It is concluded that J6 strain has better fermentation ability and tolerance， in order to provide assistance for the development of fermented donkey dairy products.

Key words： yeast; separation and screening; tolerance; fermentation characteristics

收稿日期：2023-06-23

基金項目：喀什大学校内课题（（19）2647）；国家级大学生创新创业训练计划项目（S201910763004）

作者简介：刘飞（1993－），男，讲师，博士研究生，研究方向：乳制品发酵。

发酵驴乳是生驴乳在特定发酵剂作用下，经发酵制成的风味优良、形态均一的凝乳状产品[1]。驴乳发酵后的风味物质和营养价值得到较大提升[2]，在乳酸菌、酵母菌作用下，发酵驴乳中乳酸、醋酸、醇类、胞外多糖和游离氨基酸等风味活性物质含量明显增加[3]，并提高了人体对钙、铁、磷、维生素及蛋白质的吸收利用率[4]，使非酯化脂肪酸含量增加，更易消化吸收[5]。而酵母菌作为发酵过程中的重要参与者，在发酵食品中应用广泛，如在发酵肉制品、酒类、黄豆酱、酱油[6]及发酵乳品生产中，对产品的风味提升、品质改良有重要作用[7-8]。因此，对发酵驴乳中酵母菌的分离筛选及发酵特性研究对其产品风味提升、品质改良有重要意义。

酵母菌种类繁多，在食品、药品、发酵行业及农业生产中有很高应用价值[9]。目前，酵母菌的分离鉴定技术较成熟，杨雪峰等[10]利用WL营养培养基鉴定葡萄酒中相关酵母菌，王冠群等[11]通过YPD菌落形态、WL营养培养基聚类分析研究新疆传统发酵食品中的酵母菌菌群结构。本文使用YPD及WL培养基对新疆岳普湖县发酵驴乳中的酵母菌进行分离、筛选、纯化和表型初步鉴定，对活性较优菌株的发酵特性及耐受性进行研究，以期得到可提升发酵乳制品风味品质及营养价值的优良酵母菌株，为新疆发酵驴乳制品的开发研究提供一些帮助。

1 材料与仪器

1.1 样品采集

从新疆岳普湖县农户家中采集鲜驴乳，用灭菌的玻璃瓶密封贴标后于－4 ℃冰盒中保藏。随后加入少量酸奶于30 ℃发酵8 h，进行酵母菌筛选实验。

1.2 实验试剂

酵母浸出粉胨葡萄糖（YEPD）培养基：酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 L。

酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基：酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L。

WL营养琼脂培养基：葡萄糖50 g、琼脂20 g、蛋白胨5 g、酵母浸粉4 g、氯化钙0.125 g、硫酸镁0.125 g、氯化钾0.425 g、磷酸二氢钾0.55 g、氯化铁0.002 5 g、硫酸锰0.002 5 g、溴甲酚绿0.022 g、蒸馏水1 L，pH 5.5，121 ℃灭菌20 min。

1.3 仪器及设备

BSA224S万分之一天平 美国 Mettler Toledo 公司；LE2002E/02电子天平 北京赛多利斯天平有限公司；BCD-265F冷藏冷冻箱 合肥荣事达电子电器集团有限公司；LAC-5040S全自动高压灭菌锅 诸城市衡石机械有限公司；PHS-3C型pH计 上海精密科学仪器有限公司；SW-CJ超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；DNP-9272智能生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司；SHZ-B水浴恒温振荡器 上海博迅实业有限公司；S/NS 1115989光学显微镜 义乌市楚达光学仪器厂。

2 实验方法

2.1 酵母菌的分离与纯化

取1 mL酸驴乳样品于9 mL无菌水中充分混匀，28 ℃恒温培养12 h。取1 mL接种于YEPD液体培养基中，28 ℃活化24～48 h，梯度稀释10-2～10-7。吸取200 μL不同浓度的菌液加到含有氯霉素（50 mg/mL）的YPD培养基中进行涂布，28 ℃培养24 h。观察菌落形态后挑取表面光滑湿润、中间隆起、具有典型酵母菌形态特征的单菌落进行平板划线，纯化培养2次后在显微镜下观察其菌体形态及繁殖方式，于4 ℃保藏备用。

2.2 WL培养基菌株形态观察

将通过YPD培养基纯化保藏的菌种活化后，划线接种于WL培养基中，28 ℃恒温培养5 d观察记录菌落的颜色和形态[12]。

2.3 生理生化实验

以YPD培养基为基础，配制糖发酵、碳源、氮源同化实验所需培养基。参照《真菌鉴定手册》[13]及《酵母菌的特征与鉴定手册》[14]对驴酸乳中初筛到的酵母菌进行生理生化实验，并结合菌株在WL培养基中的形态特征和生理生化实验结果，对菌株进行初步鉴别。

2.4 发酵特性研究

2.4.1 产气性能的测定

酵母菌的产气情况在一定程度上反映了菌株的发酵能力。选择杜氏小管发酵法测定菌株的产气性能[15]：在10 mL YEPD液体培养基中加入0.5 mL菌液，放入倒置的杜氏小管（管内无气体）中，于28 ℃恒温静置培养48 h。记录产气时间、产气量，重复测定3次，筛选出生长和发酵性能较好的菌株。

2.4.2 还原糖的测定

将酵母菌接种至YEPD液体培养基中，28 ℃培养72 h。采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量[16]，每隔24 h测定一次发酵液中还原糖含量。

2.5 耐受性的测定

2.5.1 温度耐受性实验

将酵母菌划线接种于YPD固体培养基中，在不同温度（30，35，40，45，50 ℃）条件下培养5 d，观察菌落生长情况。通过菌株的生长情况，测定其温度耐受性[17]。

2.5.2 pH耐受性实验[18]

用乳酸调节YEPD液体培养基的pH值为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5。按接种量2%接入不同pH值的15 mL试管中（内放倒置的杜氏小管），28 ℃恒温静置培养3 d。观察各杜氏小管内气体充盈情况，判断各菌株的pH耐受性。

2.5.3 糖耐受性[19]

以YPD培养基为基础，配制不同葡萄糖浓度的固体培养基，葡萄糖浓度设置为300，350，400，450，500 g/L。将酵母菌株划线接种在不同葡萄糖浓度的YPD培养基中，于28 ℃恒温培养48 h观察菌株在不同葡萄糖浓度培养基中的生长情况。

3 结果与分析

3.1 酵母菌的分离筛选

3.1.1 酵母菌的分离

驴乳自然发酵后摇匀涂布，挑取单菌落。在YPD培养基中分离纯化得到9株酵母菌，编号为J1～J9。其中J6、J9 YPD培养基划线结果见图1。随后通过镜检观察各菌株的形态结构，J1、J2为圆形，无假菌丝，有子囊孢子；J3、J4、J5、J8、J9为椭圆形，有假菌丝和子囊孢子；J6、J7为卵圆形，具有明显的细胞核结构，繁殖方式为芽殖，有假菌丝，较弱。

3.1.2 WL培养基菌株形态特征及生理生化实验结果

将通过YEPD液体培养基活化后的菌株接种于WL培养基中，进行划线分离观察其菌落颜色、大小及形态特征。与Cavazza等描述的菌株形态特征比对分析（见图2和表1）后，可初步鉴定菌株J1、J2、J5表型为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniapora uvarum），菌株J3、J4为克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri），菌株J6、J7为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），菌株J8、J9为拜尔接合酵母（Zygosaccharomyces）[20-22]。

在同類别酵母中选取活性较好的菌株J2、J4、J6、J9进行生理生化实验，结果见表2。

由表2可知，在碳源同化实验中4株菌均可同化蔗糖，J2不可同化乳糖，J4、J6不可同化木糖，J6对乳糖的同化能力较弱。氮源同化中J4、J6、J9均不能同化硝酸钾，除J4外，其他3株菌均可同化尿素。糖发酵实验中除J4不能利用麦芽糖、蔗糖发酵产气外，其他3株菌均可利用麦芽糖、蔗糖。根据生理生化实验结果对比《酵母菌的特征与鉴定手册》[14]描述以及结合WL营养培养基表型观察，可初步鉴别菌株J2为葡萄汁有孢汉逊酵母，J4为克鲁维毕赤酵母，J6为酿酒酵母，J8为拜尔接合酵母。

3.2 发酵特性结果

3.2.1 产气实验结果

4株菌的产气能力见表3。

由表3可知，菌株J6的产气能力最强，在24 h就可使杜氏小管中产生一半气体，在48 h可使杜氏小管中充满气体。菌株J9的產气能力较强，48 h可使杜氏小管中产生3/4气体。菌株J4的产气能力最弱，在48 h才使杜氏小管中产生1/4气体。

3.2.2 还原糖测定实验结果

酵母菌生长代谢中通过糖代谢生产代谢产物。因此，还原糖的测定可以反映微生物的生长代谢能力。利用测定还原糖含量的方法来反映菌株的发酵能力。

由图3可知，在第1天时菌株J4消耗的还原糖含量相对较多，第2天时菌株J9的还原糖总消耗量较多，而第3天时J6发酵液中剩余的还原糖含量最少，说明其消耗的还原糖含量最多，发酵能力相对最优；菌株J9次之，还原糖含量也较低，说明其也具有较好的发酵能力；而菌株J2发酵液中剩余的还原糖含量最多，消耗量最少，说明其发酵消耗还原糖的能力相对较差。

3.3 酵母菌耐受性测定

3.3.1 菌株耐温性

酵母菌生长需要一定的温度条件，在适宜温度下才能进行正常发酵，但若超过或者低于适宜温度则生长能力会受到抑制[23]。将实验菌株J2、J4、J6、J9在不同温度下进行培养，实验结果见表4。

由表4可知，生长温度在50 ℃时酵母菌全部失去生长能力；45 ℃时菌株J2、J9停止生长，J4、J6生长缓慢；而在40 ℃下菌株J2也停止生长，J9生长缓慢，J4和J6还可正常生长；35 ℃下菌株J4的生长活性最好。因此，综合各温度条件下菌株的耐受性情况，可得出菌株J4的耐温性相对较好，J2相对较差。

3.3.2 pH耐受性测定

酵母菌一般在pH值为4.5～5.5时生长较好[24]。在过酸环境中其生长会受到抑制，发酵能力下降，甚至没有活性。菌株J2、J4、J6、J9在不同pH值培养基中的生长产气情况见表5。

由表5可知，pH值在3.0～4.5范围内，各菌株的产气能力相差不大，说明其发酵生长没有受到较大影响；而当pH为2.5时，菌株J2停止产气，其他菌株产气量变为1/2，说明各菌株的生长活性开始受到抑制；在pH为2.0时，菌株J6的产气能力没有受到影响，而菌株J4、J9的产气量变为1/4，产气能力下降。综上可以看出，菌株J6在各pH值下的产气能力相对较强，生长活性较好，酸耐受性最优。

3.3.3 糖耐受性测定

糖浓度对酵母菌的生长活性具有一定影响[25]，一般乳制品中糖浓度在12%～20%时酵母菌的生长发酵能力最好，随着糖浓度的增加，生长能力逐渐受到抑制。菌株J2、J4、J6、J9对不同糖浓度的耐受性结果见表6。

由表6可知，当糖浓度在300，350 g/L时各菌株生长状况均较好，未受到抑制。而当糖浓度达到400 g/L时，菌株J2的生长活性略有下降，但仍可生长，其他菌株的生长活性依旧较强，不受影响。当糖浓度达到450 g/L时，菌株J6的生长活性较弱，菌株J2停止生长，菌株J4、J9仍有较好的生长能力。而当糖浓度为500 g/L时，只有菌株J9还具有较好的生长活性，菌株J4的生长受到抑制，菌株J6停止生长。因此可以看出，在高糖浓度下菌株J4 的耐受性最优，菌株J2的糖耐受性相对较差，在糖浓度高于400 g/L时停止生长。

4 结论

从喀什地区岳普湖县发酵驴乳中分离纯化得到9株酵母菌。将菌株分离纯化后接种到WL固体培养基中，观察形态特征表型并结合生理生化实验结果，将9株酵母菌初步鉴定为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniapora uvarum）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和拜尔接合酵母（Zygosaccharomyces）4类。随后同种各选取一株活性较强的菌株进行发酵特性和耐受性研究，测定了菌株在不同温度、pH和糖浓度下的生长情况。最后得出菌株J6的产气能力及还原糖消耗速率较优，说明其发酵能力相对较强，且在耐酸性实验中pH为2.0时仍具有一定的发酵能力，耐酸性也相对较优。而菌株J4的耐温性相对较好，各温度下的生长情况均较优。菌株J9在不同糖浓度中均有良好的生长活性，耐糖性最优。但结合发酵特性及耐受性实验结果来看，菌株J6的综合发酵、耐受能力较优。在后续的研究中，对菌株J6在乳制品发酵中的风味及潜在益生性再进行研究筛选，以期得到一株可提升发酵乳制品风味及功能特性的优良菌株。

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