葛仙米酶解工艺优化及复合调味素的研制

卢玉翠 冯盈盈 黄晴霞 高鑫 赵立春 廖夏云

摘要：對葛仙米进行酶解工艺优化并制作一款以葛仙米为主要原料的复合调味素。利用单因素试验和正交试验，以氨基酸态氮含量为指标，感官评价和美德拉反应综合分析结果表明，最佳酶解工艺条件为胰蛋白酶浓度9%、时间2 h、温度50 ℃，此条件下氨基酸态氮含量为0.713 g/100 g；葛仙米美拉德反应最佳条件为葛仙米质量分数25%、反应时间75 min、反应温度70 ℃、100 g葛仙米液中葡萄糖添加量5 g，此条件下葛仙米液的味道最佳；葛仙米复合调味素的最佳配方为葛仙米液40 g、食盐3 g、蔗糖3 g、鲜味剂4 g、香菇汁3 g、玉米变性淀粉10 g。该试验研制了一款颗粒大小均匀、淡黄色、滋味鲜美的葛仙米复合调味素，为葛仙米的综合开发利用提供了一定的理论基础。

关键词：葛仙米；氨基酸态氮；酶解；美拉德反应；复合调味素

中图分类号：TS264.9      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）12-0111-06

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Process of Nostoc sphaeroides Kütz.

and Development of Compound Seasoning Elements

LU Yu-cui1， FENG Ying-ying1， HUANG Qing-xia1，

GAO Xin1， ZHAO Li-chun2*， LIAO Xia-yun1，2*

（1.School of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530021， China; 2.Guangxi

Key Laboratory of Medicine and Food Homologous Resources Development， Guangxi Zhuang

Yao Medicine Engineering Technology Research Center， Nanning 530021， China）

Abstract： The enzymatic hydrolysis process of Nostoc sphaeroides Kütz. is optimized and a compound seasoning element is prepared with Nostoc sphaeroides Kütz. as the main raw material. Using single factor test and orthogonal test， with the content of amino acid nitrogen as the index， the results of sensory evaluation and comprehensive analysis of Maillard reaction show that the optimal enzymatic hydrolysis process conditions are trypsin concentration of 9%， time of 2 h and temperature of 50 ℃. Under such conditions， the content of amino acid nitrogen is 0.713 g/100 g. The optimal Maillard reaction conditions of Nostoc sphaeroides Kütz. are as follows： Nostoc sphaeroides Kütz. mass fraction of 25%， reaction time of 75 min， reaction temperature of 70 ℃， and glucose addition amount of 100 g Nostoc sphaeroides Kütz. solution is 5 g. Under such conditions， the taste of Nostoc sphaeroides Kütz. solution is the best. The optimal formula of the compound seasoning elements is 40 g Nostoc sphaeroides Kütz. solution， 3 g salt， 3 g sucrose， 4 g flavor enhancer， 3 g Lentinus edodes juice and 10 g modified corn starch. In this test， a delicious and light yellow Nostoc sphaeroides Kütz. compound seasoning element with uniform particle size is developed， which has provided a certain theoretical basis for the future comprehensive development and utilization of Nostoc sphaeroides Kütz..

Key words： Nostoc sphaeroides Kütz.; amino acid nitrogen; enzymatic hydrolysis; Maillard reaction; compound seasoning element

葛仙米（Nostoc sphaeroides Kütz.）又称天仙米、田木耳，为单细胞丝状蓝藻，是一种药食兼用的珍贵食品[1-2]。根据记载，葛仙米具有益气明目、解热、清膈、利肠胃、久食延年、消除疲劳、收敛、治夜盲症等功效[3]，现代研究表明，葛仙米蛋白具有较好的调节免疫、抗炎、抗氧化、抗紫外损伤、抗肿瘤等功能[4-5]。葛仙米含有多种营养成分，如粗蛋白48.61%、粗脂肪8.11%、碳水化合物12.69%、粗灰分5.50%等[6]。近年來，人工培养技术已趋于完善，葛仙米越来越多地被运用于食品[7]、保健品[8]和化妆品[9]中。《本草纲目》记载：“葛仙米，出勾漏草泽间；采得曝干，仍渍以水，可作羹入馔，味甚鲜；初取时如小鲜木耳，紫绿色，以醋拌之，肥脆可食，干则以水浸之，与肉同煮，作木真味”。葛仙米既是传统中药，又可以作为营养价值较高的调味素原材料。

葛仙米有两层细胞壁，内层由果胶和纤维素组成，外层的胶质化学成分主要是果胶和多糖。葛仙米常富钙，是因为在一定条件下多糖容易氧化成糖酸，从而容易与金属离子结合而富集金属，并且多糖具有大量羟基，较易形成氢键，导致在胶质鞘的层理中有石灰质的沉淀。葛仙米的这一细胞结构限制了对其营养物质的吸收利用，只有使其破壁，营养物质才能得以释放而得到充分利用[10]。目前，多采用超声辅助法[11]、反复冻融法[12]、酶法[13]、高压均质法[14]和球磨法[15]等对藻类进行破壁。

本研究以葛仙米为原料，经酶解工艺优化和美拉德等一系列反应，制备一款葛仙米复合调味素，赋予其鲜美的风味和营养价值，以期为葛仙米的深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

考马斯亮蓝G250（分析级）：上海现代制药股份有限公司；牛血清白蛋白（分析级）：北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白酶（食品级）：南宁庞博生物工程有限公司；I+G（呈味核苷酸二钠）：河南万邦实业有限公司。

JY92-IIN型超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技有限公司；UV-2600i型紫外可见分光光度计 日本岛津公司；SPX-250A生化培养箱 上海煜南仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 葛仙米液的制备

将清洗干净的葛仙米鲜品加入PBS缓冲液中，在料液比为1∶50（g/mL）的条件下，超声功率500 W，40 ℃超声30 min，随后将样品溶液在冻融时间4 h、冻融温度－20 ℃的条件下反复冻融处理3次，过滤，向滤液中加入胰蛋白酶酶解，高温灭酶15 min，冷却，4 000 r/min离心15 min，上清液即为葛仙米液，备用。

1.2.1.1  氨基酸态氮含量测定

参照黎瑞珍等[16]的方法测定氨基酸态氮含量。以光密度值为纵坐标，氮的质量（μg）为横坐标，拟合得到回归方程y=0.010 5x+0.606 8，R2=0.997 1，取葛仙米液1.0 mL至100 mL容量瓶中，加水定容，吸取2.0 mL按同样操作得到待测样品溶液，将得到的光密度值代入回归方程，通过计算得到样品中氨基酸态氮含量（g/100 g）。

1.2.1.2 酶解单因素试验

试验考察酶用量、酶解时间、酶解温度3个因素对葛仙米氨基酸态氮含量的影响。各因素梯度分别为酶用量3%、5%、7%、9%、11%；酶解时间0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h；酶解温度35，40，45，50，55 ℃。

1.2.1.3 酶解正交试验

以单因素试验结果为基础，以氨基酸态氮含量为指标，进行L9（33）正交试验。因素A胰蛋白酶用量为5%、7%、9%，因素B酶解时间为1.5，2.0，2.5 h，因素C酶解温度为45，50，55 ℃。

1.2.2 葛仙米复合调味素研制工艺

葛仙米液进行美拉德反应→葛仙米美拉德液感官评价→混合辅料浓缩制软材→制粒→干燥（使含水率在1%以下）→包装→对葛仙米复合调味素进行感官检验。

1.2.2.1 感官评定标准

选择10位感官人员对成品进行打分，结果取平均值。葛仙米美拉德液感官评分标准为气味（30分）：香气自然清新，23～30分；香气微弱，几近没有，15～22分；无明显香气，＜15分。滋味（30分）：滋味鲜美纯正，23～30分；滋味不明显，15～22分；无滋味且略有腥味，＜15分。口感（40分）：口感浓郁丰厚，入口细腻，26～40分；口感浓郁，入口感觉一般，10～25分；鲜味不明显，略有焦糊味，＜10分。葛仙米复合调味素感官评分标准为滋味（30分）：滋味鲜美纯正，23～30分；滋味不明显，几近没有，15～22分；无滋味且略有腥味，＜15分。颜色（30分）：淡黄色，23～30分；黄色，15～22分；深黄色或白色，＜15分。形态（40分）：形状均匀完整，26～40分；形状完整，但有较大颗粒或较多细粉，10～25分；形状不完整，细粉和大颗粒较多，＜10分。

1.2.2.2 葛仙米美拉德液单因素试验

试验考察了葛仙米液质量分数、温度、时间、葡萄糖添加量4个因素对葛仙米美拉德液感官品质的影响。各因素梯度分别为葛仙米液质量分数10%、15%、20%、25%、30%；温度50，60，70，80，90 ℃；时间30，60，90，120，150 min；100 g葛仙米液的葡萄糖添加量3，4，5，6，7 g。

1.2.2.3 葛仙米美拉德液正交试验

在单因素试验的基础上，以感官评分为指标，进行四因素四水平正交试验。因素D葛仙米液质量分数为22.5%、25%、27.5%，因素E温度为65，70，75 ℃，因素F时间为75，90，105 min，因素G葡萄糖添加量为4.5，5.0，5.5 g。

1.2.2.4 葛仙米复合调味素配方

a.单因素试验

试验以感官评分为指标，考察食盐添加量、蔗糖添加量、鲜味剂（味精∶I+G为20∶1）添加量、香菇汁添加量4个因素对葛仙米复合调味素品质的影响，各因素梯度分别为食盐添加量1，2，3，4，5 g；蔗糖添加量1，2，3，4，5 g；鲜味剂添加量1，2，3，4，5 g；香菇汁添加量1，2，3，4，5 g。

b.正交试验

在单因素试验的基础上，以食鹽、蔗糖、鲜味剂（味精∶I+G为20∶1）、香菇汁添加量作为考察因素，进行四因素四水平正交试验。因素H食盐添加量为2.5，3.0，3.5 g，因素I蔗糖添加量为2.5，3.0，3.5 g，因素J鲜味剂添加量为3.5，4.0，4.5 g，因素K香菇汁添加量为2.5，3.0，3.5 g。

1.2.3 数据处理

使用SPSS、Excel、Origin 2018等软件进行相关图表的绘制和数据处理，平行测定3次，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 葛仙米酶解工艺结果

2.1.1 酶用量、酶解时间、酶解温度对葛仙米氨基酸态氮含量的影响

氨基酸态氮含量与酶用量呈正相关，当酶用量超过7%时葛仙米氨基酸态氮含量基本不变，可能是因为底物已经充分酶解，酶的作用效果不显著，氨基酸态氮含量不再随着酶用量的增加而升高，说明适当的酶添加量可使酶解产物具有更好的生物活性。该结果与刘鹏莉等[17]采用蛋白酶对扇贝裙边进行酶解，其蛋白酶添加量的变化情况一致。综合考虑，胰蛋白酶用量为7%最适用于葛仙米的酶解。随着酶解时间的延长，氨基酸态氮含量逐渐增加，酶解2 h后，氨基酸态氮含量减少，说明酶解时间过长会造成营养成分损失，不利于酶解[18]，因此，胰蛋白酶的最佳酶解时间为2 h。在酶解温度35～50 ℃时氨基酸态氮含量随着温度的升高而升高，而50 ℃后出汁率与酶解温度呈负相关。当温度高于50 ℃后，酶分子结构发生变化，酶的生物活性被破坏，无法发挥作用[19]，导致氨基酸态氮含量反而下降，同时结合工业生产和成本控制来看，选择胰蛋白酶的最佳酶解温度为45 ℃。

2.1.2 酶解工艺正交试验结果

由极差分析可知影响因素主次顺序为RA＞RB＞RC，即酶用量对葛仙米氨基酸态氮含量的影响最大，其次是酶解时间，酶解温度的影响最小。胰蛋白酶最优酶解条件为酶解温度50 ℃、酶解时间2 h、酶用量9%，在该条件下进行验证试验，试验结果为葛仙米氨基酸态氮含量0.713 g/100 g，大于其他组合的最大氨基酸态氮含量，由方差分析结果可知，在显著性水平α=0.05下，因素A酶用量和因素B酶解时间影响显著，因素C酶解温度影响不显著，本试验结果与杜小琴等[20]的结果相似。

2.2 葛仙米复合调味素研制工艺结果

2.2.1 不同葛仙米液质量分数、反应温度、反应时间、葡萄糖添加量对美拉德反应感官评分的影响

由图1中a可知，随着葛仙米液质量分数的增加，美拉德反应程度提升，产生了口感独特的物质，感官评分上升；质量分数超过25%，感官评分略有下降。在美拉德反应过程中，随着葛仙米液质量分数的增加，具有独特香味、口感的葛仙米液赋予美拉德反应产物良好的口感，同时过量的葛仙米液在反应过程中可能造成口感稍差，影响美拉德反应产物的整体口感，使感官评分降低，最终确定葛仙米液质量分数为25%。由图1中b可知，反应温度是影响美拉德反应的重要因素，随着温度的升高，葛仙米液的香味及口感也会提高，而且较高的温度有利于产生大量香味，当反应温度超过70 ℃时，会产生较强烈的异味；温度过低，反应不充分，香气不够浓郁[21]，因此，最终确定反应温度为70 ℃。由图1中c可知，当反应时间增加到90 min时，随着反应时间的延长，葛仙米液不断反应，产生一系列风味物质，使得感官评分升高，而反应时间超过90 min后，反应产物中会产生少量焦糊的气味[22]，使得感官评分降低，最终确定反应时间为90 min。由图1中d可知，随着葡萄糖添加量的增加，美拉德反应程度提高，产生了更多的香味物质，感官评分上升；添加量超过5 g时，感官评分明显下降。在美拉德反应过程中，随着葡萄糖添加量的增加，具有香味的小分子物质不断生成，赋予美拉德反应产物良好的风味，达到反应平衡后反应速率降低，同时过量的葡萄糖在反应过程中可能生成了具有不良气味的大分子物质，会影响美拉德反应产物的整体风味，使感官评分降低，最终确定葡萄糖添加量为5 g。

2.2.2 葛仙米美德拉液正交试验结果

由正交试验结果可知，各因素对葛仙米美拉德反应液综合评分影响的因素主次顺序为RD＞RG＞RE＞RF，即葛仙米液质量分数对美拉德反应感官评分的影响最大，其次是葡萄糖添加量和反应温度，而反应时间对美拉德反应感官评分的影响最小。最佳的美拉德反应条件为葛仙米液质量分数25%、反应温度70 ℃、反应时间75 min、葡萄糖添加量5 g，此时感官评分为94.3分。在最佳条件下进行3次平行试验，并对美拉德反应液进行感官分析，最后得到一款鲜味独特、口味良好、口感醇厚、香气清新的葛仙米液。

2.2.3 不同食盐添加量、蔗糖添加量、鲜味剂添加量、香菇汁添加量对葛仙米复合调味素感官评分的影响

由图2中a可知，食盐添加量会影响葛仙米复合调味素的风味，含量过高则会过于酸涩而使得消费者难以接受，含量过低则使葛仙米复合调味素只有甜味，风味单一，缺乏回味，恰当的酸味才会使葛仙米复合调味素更具有风味[23]，因此，当食盐添加量为3 g时感官评分最高，为83.2分，此时葛仙米复合调味素酸味适中，风味令人满意。由图2中b可知，不同蔗糖添加量之间的感官评分差异不明显，蔗糖添加量为3 g时感官评分最高，恰当地使用蔗糖，能确保葛仙米复合调味素应有的味道和质量，不仅能提高甜味，而且可抑制酸味，使得调味素口味和谐[24]。由图2中c可知，随着鲜味剂添加量的增加，感官评分明显提高，但添加量超过4 g后，感官评分下降，鲜味剂可以补充或增加葛仙米复合调味素原有的风味物质，但添加过多会影响口感[25]，因此，最佳鲜味剂添加量为4 g。由图2中d可知，香菇味道鲜美，香气沁人，营养丰富，随着香菇汁添加量的增加，感官评分显著提高，添加量超过3 g后，感官评分骤降，可能是因为过多的香菇汁影响了葛仙米复合调味素的风味[26]，因此，最佳香菇汁添加量为3 g。

2.2.4 葛仙米复合调味素配方正交试验结果

由正交试验结果可知，4个因素对葛仙米美拉德反应液综合评分影响的主次顺序为RJ＞RK＞RH＞RI，即鲜味剂添加量＞香菇汁添加量＞食盐添加量＞蔗糖添加量，获得的最佳美拉德反应条件为鲜味剂添加量4 g、食盐添加量3 g、蔗糖添加量3 g、香菇汁添加量3 g，此时感官评分为95.5分。在最佳条件下进行3次平行试验，并对葛仙米复合调味素进行感官分析，最后得到颗粒均匀、淡黄色、味道鲜美的葛仙米复合调味素。

2.2.5 葛仙米复合调味素干燥工艺结果

在本研究中发现制成的葛仙米复合调味素在贮存过程中有少许吸湿性，为了进一步优化产品，从效率和环保经济的角度考虑，选择45 ℃真空干燥30 min，该条件能降低葛仙米复合调味素的水分含量，使含水率在1%以下。

2.2.6 理化指标检测结果

由图3可知，葛仙米复合调味素呈均一颗粒状，淡黄色，形态均匀，不粘连，久置无潮解现象。

2.2.7 微生物检测结果

最优产品按照国家标准进行检测，参照GB 10133－2014《食品安全国家标准 水产调味品》对菌落总数及大肠菌群的要求，未检测出菌落总数及大肠菌群，符合卫生要求。

3 结论

本研究探讨了葛仙米酶解工艺优化及复合调味素的研制，结果表明，葛仙米最佳酶解工艺条件为胰蛋白酶用量9%、酶解时间2 h、酶解温度50 ℃，此条件下氨基酸态氮含量為0.713 g/100 g。葛仙米美拉德反应最佳条件为葛仙米液质量分数25%、反应时间75 min、反应温度70 ℃、100 g葛仙米液中葡萄糖添加量5 g，此条件下葛仙米液的味道最佳；葛仙米复合调味素最佳配方为葛仙米液40 g、食盐3 g、蔗糖3 g、鲜味剂4 g、香菇汁3 g、玉米变性淀粉10 g，水浴加热混合均匀后干燥，取出的物料呈揉之成团、触之易散的状态，将物料过筛制粒后于45 ℃真空干燥30 min，成品的理化指标和微生物检测结果均符合国家标准，得到一款颗粒大小均匀、淡黄色、滋味鲜美的葛仙米复合调味素。

参考文献：

[1]易思富，田云.葛仙米化学成分及生理活性研究进展[J].食品研究与开发，2020，41（9）：189-194.

[2]杨丽涛，刘银路，张波.葛仙米多糖对高脂小鼠血脂和肠道微生物的影响[J].微生物学报，2022，62（3）：785-796.

[3]苏攀峰.葛仙米多糖的提取分离、结构和活性研究[D].上海：上海海洋大学，2018.

[4]余佳，王生，许文琦，等.葛仙米藻胆蛋白粗提物、藻蓝蛋白和藻红蛋白的体外抗氧化活性比较研究[J].食品研究与开发，2019，40（23）：104-108.

[5]方倩.葛仙米对小鼠生长和免疫功能的影响[D].新乡：河南师范大学，2015.

[6]梅邢，汪琼，田瑞，等.加工方式对葛仙米营养成分的影响[J].湖北民族学院学报（自然科学版），2017，35（4）：374-378.

[7]余义，王海英，杨英，等.营养型葛仙米果冻的制作工艺研究[J].氨基酸和生物资源，2016，38（3）：30-35.

[8]汪兴平，程超，周志，等.野生葛仙米营养成分分析及评价[J].食品科学，2002（8）：288-290.

[9]王玉兰，董明，黄凤飞，等.一种含有葛仙米提取物的美白保湿面膜液及其制备方法：中国，CN201510570868.X[P].2018-01-23.

[10]程超，薛峰，汪兴平，等.反复冻融增强葛仙米藻胆蛋白抗氧化特性研究[J].食品科学，2011，32（23）：121-124.

[11]GREENLY J M， TESTER J W. Ultrasonic cavitation for disruption of microalgae[J].Bioresource Technology，2015，184：276-279.

[12]GHOSH T， MISHRA S. Studies on extraction and stability of C-phycoerythrin from a marine cyanobacterium[J].Frontiers in Sustainable Food Systems，2020，4：102.

[13]TAVANANDI H A， RAGHAVARAO K. Ultrasound-assisted enzymatic extraction of natural food colorant C-phycocyanin from dry biomass of Arthrospira platensis[J].LWT-Food Science and Technology，2020，118：108802.

[14]ZHANG R， GRIMI N， MARCHAL L， et al. Application of high-voltage electrical discharges and high-pressure homogenization for recovery of intracellular compounds from microalgae Parachlorella kessleri[J].Bioprocess and Biosystems Engineering，2019，42（1）：29-36.

[15]ALAVIJEH R S， KARIMI K， WIJFFELS R H， et al. Combined bead milling and enzymatic hydrolysis for efficient fractionation of lipids， proteins， and carbohydrates of Chlorella vulgaris microalgae[J].Bioresource Technology，2020，309：123321.

[16]黎瑞珍，符素芳，苏小妹，等.儿童酱油中氨基酸态氮含量的测定[J].食品安全导刊，2018（27）：120-121.

[17]刘鹏莉，遇艳萍，王晶，等.酶解联合美拉德反应制备具有抗氧化活性的扇贝裙边调味基料[J].食品安全质量检测学报，2022，13（23）：7708-7714.

[18]高文涛，贾艺彬，温艳斌，等.酶解法制备黄花菜汁工艺优化及抗氧化性分析[J].食品工业科技，2023，44（12）：164-171.

[19]方芳，李雅倩，周全，等.裙带菜功能低聚糖的制备工艺优化[J].中国酿造，2022，41（9）：161-168.

[20]杜小琴，夏炎，张小琴，等.鹿血的酶解工艺优化及其抗运动疲劳活性评价[J].安徽农业大学学报，2021，48（3）：518-522.

[21]许春平，张弛，薛云，等.红薯美拉德反应制备食用烤香香料的工艺优化[J].中国调味品，2023，48（3）：191-198.

[22]于珍，布冠好，王美月，等.花生肽的制备及其美拉德反应产物风味特性研究[J].食品安全质量检测学报，2022，13（14）：4665-4673.

[23]张历.基于美拉德反应的真姬菇调味品的研究[D].福州：福建农林大学，2015.

[24]MBEDANE DONGBY PACHECO J C I. 蔗糖加工过程美拉德反应的控制及优化[D].无锡：江南大学，2012.

[25]汪建明，马晓蕾，卢星达.营养鲜味剂的工艺研究[J].中国食品添加剂，2013（1）：62-66.

[26]楚文靖，张瑞，周娜，等.香菇风味物质研究进展[J].安徽农学通报，2019，25（20）：39-41.

收稿日期：2023-07-03

基金项目：国家青年岐黄学者项目（2020-7）；国家自然科学基金项目（82160775）

作者简介：卢玉翠（1996-），女，硕士研究生，研究方向：中藥化学。

*通信作者：赵立春（1980-），男，研究员，博士，研究方向：药食同源产品的研究与开发；

廖夏云（1985-），女，瑶族，副教授，博士，研究方向：保健食品的研究与开发。