基于指纹图谱结合化学模式识别对狗脊药材的质量评价

贾天宁，刘 芳，陈 鹏，李先宽，马 琳*，黄钦华

1. 天津中医药大学第一附属医院，天津 300381

2. 国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300381

3. 天津中医药大学，天津 301617

4. 厦门医学院附属第二医院，福建 厦门 361021

狗脊为蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz(L.) J. Sm.的干燥根茎，别名“金毛狗脊”。主产于广西、广东、福建、湖北等地，具有祛风湿、补肝肾、强腰膝之功效。临床上可治疗风湿痹痛、腰膝酸软、下肢无力等症状[1]。近年来对狗脊化学成分研究发现其化学成分主要有蕨素类，水溶性酚酸类、鞣质、淀粉、挥发油、糖及糖苷类等化合物[2]。本课题组对国家中药标准化项目-生血宝合剂标准化建设进行研究，狗脊是生血宝七味药之一，对狗脊进行质量控制不可忽视。《中国药典》2020 年版[3]，仅对其原儿茶酸这单一指标进行含量测定，也曾有文献对狗脊中原儿茶醛等5 个成分进行含量测定[4]，但中药成分复杂，无论是单一成分或多成分测定，都难以全面反映狗脊整体质量的优劣。而指纹图谱在中药分析方面具有整体、灵敏反映样品特征的优点，结合化学模式识别对指纹图谱进行数据降维、识别和分类，寻找药材间的差异性，用于筛选质量差异标志物。查阅文献发现，狗脊的指纹图谱和化学模式识别的文献较少，故本实验以狗脊为研究对象，通过高效液相色谱（HPLC）指纹图谱结合化学模式识别技术整合分析指纹图谱中提取共有峰的面积数据，得到不同产地的特征化学成分并含量测定，建立狗脊有效成分以期为狗脊的质量标准研究、相关制剂的质量控制以及资源开发利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

岛津高效液相色谱仪Shimadzu SPD-20AT，色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 µm）；AB135-S 型十万分之一电子分析天平（Mettler Toledo 公司）；KQ5200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪有限公司）。

1.2 试剂

对照品5-羟甲基糠醛（批号20051201）、原儿茶醛（批号20082402）、原儿茶酸（批号20082901）、紫云英苷（批号19042203）成都曼思特生物科技有限公司；咖啡酸（批号110885-201703）中国食品药品检定研究所，质量分数均≥98%。分析纯甲醇购自天津市化学试剂供销公司，色谱纯甲醇购自美国Sigma 公司，冰醋酸（分析纯，天津市化学试剂供销公司），水为娃哈哈纯净水。

1.3 药材

狗脊药材采自广东、广西、浙江、福建等，共16 批次。经天津中医药大学马琳教授鉴定为蚌壳蕨科植物金毛狗脊C.barometz(L.) J. Sm.的干燥根茎。狗脊样品来源见表1。

表1 16 批次狗脊来源Table 1 Sample information of C. barometz

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 µm），流动相1%冰醋酸水溶液（A）-甲醇（B），流动相梯度洗脱程序为0～17 min，93%～85% A；17～25 min，85%～76% A；25～30 min，76%～74% A；30～45 min，74%～65% A；45～52 min，65%～40% A；52～55 min，40%～10% A；55～65 min，10%～93%A；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 μL；检测波长280 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 分别取对照品5-羟甲基糠醛（5-HMF）、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、紫云英苷适量，精密称定，置量瓶中，加入甲醇-1%冰醋酸水溶液（70∶30）制成含5-HMF 679 μg/mL、原儿茶醛 24.0 μg/mL、原儿茶酸 15.0 μg/mL、咖啡酸42.5 μg/mL、紫云英苷45.0 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取本品粉末（过三号筛）约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-1%冰醋酸水溶液（70∶30）混合溶液50 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30min，放冷，用甲醇-1%冰醋酸水溶液（70∶30）混合溶液补足减失的质量，摇匀，0.22 μm 的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一狗脊供试品（S1）溶液，连续进样6 次，进样量20 μL，以5-HMF 为参照峰（S），计算其他各个特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，考察仪器的精密度，各特征峰相对保留时间的RSD 值分别为0.42%、0.82%、0.54%、0.69%、0.76%，各色谱峰相对峰面积的RSD 值分别为0.55%、1.29%、0.84%、1.47%、1.53%，均小于2.0%。

2.3.2 重复性试验 取同一狗脊供试品（S1），按“2.2.1”项下制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样测定，进样量20 μL，以5 -HMF为参照峰（S），计算其他特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，考察方法的重复性。各特征峰相对保留时间的RSD 值分别为0.82%、1.76%、0.73%、0.51%、0.74%，各色谱峰相对峰面积的RSD值分别为0.16%、1.57%、1.04%、0.92%、1.24%，均小于2.0%。

2.3.3 稳定性试验 取同一狗脊供试品（S1）溶液，分别于配制后0、2、5、10、15、24 h 进样测定，进样量20 μL，以5-HMF 为参照峰，计算其他特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，考察供试品溶液的稳定性，各特征峰相对保留时间的RSD 值分别为0.17%、0.72%、1.01%、1.02%、1.25%，各色谱峰相对峰面积的RSD 值分别为0.62%、0.73%、0.89%、1.41%、1.85%，均小于2.0%。

2.4 狗脊指纹图谱的建立

2.4.1 狗脊对照指纹图谱的生成 分别精密称定16 批 狗脊样品约2.0 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723 版）软件”，对16 批狗脊样品HPLC 图谱进行分析，以S1 为参照图谱，采用中位数法，时间窗的宽度默认为0.1 min，经过多点校正之后进行自动匹配，生成16 批狗脊药材的HPLC 指纹图谱和对照图谱（R），见图1、2。

图1 狗脊HPLC 指纹图谱Fig. 1 HPLC fingerprints of C. barometz

图2 样品色谱图 (A) 与对照品色谱图 (B)Fig. 2 Chromatograms of sample (A) and reference (B)

2.4.2 特征峰的指认 16 批狗脊药材有10 个共有峰，其中指认1、2、3、5 和10 号，5 个主要特征峰：分别为5-HMF，原儿茶酸，原儿茶醛，咖啡酸，紫云英苷。

2.4.3 相似度评价 对16 批狗脊样品的指纹图谱进行相似度计算分析，选取样品中出峰时间稳定、分离度好5-HMF 作为参照峰（S），以其保留时间和峰面积为1，计算16 批狗脊样品的共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各共有峰的相对保留时间RSD 值均小于 2.0%，相对峰面积的 RSD 在64.81%～86.64%，说明不同批次样品中各成分含量差异较大，相对峰面积结果见表2。16 批狗脊样品色谱图与对照指纹图谱的相似度在0.695～0.954，表明各个产地狗脊差异较大，这可能与狗脊野生状态种植有关。相似度结果见表3。

表2 16 批狗脊指纹图谱相对峰面积Table 2 Relative peak area of common peaks in fingerprints of 16 batches of C. barometz

表3 16 批狗脊指纹图谱相似度评价结果Table 3 Results of similarity evaluation of 16 batches of C.barometz

2.5 化学模式识别分析

2.5.1 聚类分析 16 批样品HPLC 指纹图谱的10个共有峰的峰面积导入SPSS 软件进行系统聚类分析（hierarchical clustering analysis，HCA），采用组间连接的聚类方法，以平方欧式距离进行分析，结果见图3。当分类距离10 时，显示16 批样品可共聚为两类，其中来自广西的S1 和S2 聚为一类，其余地产可聚为一类。

图3 狗脊样品聚类分析图Fig. 3 Cluster analysis diagram of C. barometz samples

2.5.2 主成分分析（principal component analysis，PCA）分析 为了进一步区分各不同产地狗脊，将16 批样品的指纹图谱的10 个共有峰的峰面积为原始数据导入SPSS 软件进行处理，进行PCA。首先，进行降维因子分析，结果显示KMO 值为0.773，大于0.5，表明各变量相关性较好，以特征值大于1提取主成分，得到2 个主要成分，累积方差贡献率为88.298%，见表4；其次，用碎石图转折点检验保留主成分个数，进一步说明可提取前2 个主成分，见图4。成分矩阵（表5）结果显示，第1 个主成分信息主要来自1～7 号峰和9 号峰，其中1～3 号峰分别为5-HMF，原儿茶酸，原儿茶醛，5 号峰为咖啡酸，第2 个主成分信息主要来自第10 号峰（紫云英苷）。最后，将16 批样品的10 个共有峰峰面积导入SIMCA 14.1 软件，得到16 批不同产地样品的主成分得分图，见图5，R2X（cum）为0.75，Q2（cum）为0.645，说明该模型可靠。结果显示2 个主成分能反映不同产地狗脊的主要特征，与上述聚类分析结果一致，提示不同产地的狗脊在化学成分含量上存在差异。

表4 特征值和方差贡献率Table 4 Eigenvalues and variance contributions

图4 主成分分析碎石图Fig. 4 Scree plot of PCA

图5 狗脊PCA 得分图Fig. 5 PCA scores of C. barometz

表5 成分矩阵Table 5 Component matrix

初始因子载荷矩阵见表5，由表可见，第1 主成分主要反映了除峰8 和10 的信息，即原始指标色谱峰1～7、9 的信息，第2 主成分主要反映来自原始指标色谱峰10 的信息（载荷值＞0.7）。其中峰1 为5-HMF，峰2 为原儿茶酸，峰3 为原儿茶醛，峰5 为咖啡酸，峰10 为紫云英苷。以降维得到的2个主成分得分作为X、Y、Z 轴，得到10 个样品的PCA 得分图，结果见图5，S1、S2、S8 均与其他样品偏离，与聚类分析结果大致相同，说明广西来源的2 个样品虽然聚类分析是一类，但是可能因为生长环境或者采收季节的原因，经过PCA 分析，仍可以将S1 和S2 区别开。

2.5.3 偏最小二乘法-判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA） 建立PLS-DA 模型，可以更好地分析不同产地样本间的组内差异。结果显示，所有排列在左边的R2（cum）和Q2（cum）值都低于右边的原始点，并且Q2（cum）点的蓝色回归线有负截距，说明原始PLS-DA 模型有效，确认该分析内容在统计学层面上可信。PLS-DA 得分图及3D 图，见图6、7。结果结果显示16 批样品分可为4 组，广西2 个样品S1 和S2 以及广东样品S3 3 个产地各为一组，其余一组。结合变量重要性投影值（variable importance in projection，VIP）（图8）可知VIP＞1 的色谱峰（数值由高到低）分别为2、3、10、8 和1 号峰（原儿茶酸、原儿茶醛紫云英苷、未知化合物和5-HMF），说明这些化学成分是不同产地狗脊样品的差异性标志物。

图6 狗脊样品PLS-DA 得分图Fig. 6 PLS-DA scores of C. barometz

图7 狗脊样品PLS-DA 分析3D 图Fig. 7 3D image of C. barometz by PLS-DA

图8 狗脊样品PLS-DA 的VIP 图Fig. 8 VIP value from PLS-DA load diagram of C.barometz

2.6 狗脊中有效成分的含量测定

PCA 分析表明指纹图谱中1～3、5 号峰是影响不同产地狗脊质量的特征化学成分，分别为5-HMF、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸，是影响不同产地狗脊质量的特征化学成分。PLS-DA 结果显示，有5 个成分VIP＞1，分别对应2（原儿茶酸）、3（原儿茶醛）、10（紫云英苷）、1（5-HMF）4 个成分，以及8 号峰（未知成分）。说明不同产地这些成分含量差异较大，是产地的差异性特征有效成分，故本实验筛选5-HMF、原儿茶醛、原儿茶酸、紫云英苷作为狗脊指标性成分进行含量测定。

2.6.1 线性关系考察 精密吸取各对照品储备液适量，吸取“2.2.1”项下对照品溶液混合对照品溶液1、2、5、15、50、100 μL，成，按“2.1”项下色谱条件测定5-HMF、原儿茶醛、原儿茶酸、紫云英苷的峰面积。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算线性回归方程和相关系数（r）。结果见表6。

表6 对照品的线性方程、相关系数和线性范围Table 6 Linear equation, correlation coefficient and linear range of reference substance

2.6.2 精密度试验 取混合对照品，按“2.1”项色谱条件重复进样6 次，测得5 -HMF、原儿茶醛、原儿茶酸、紫云英苷峰面积的RSD 值分别为1.07%、1.28%、1.12%、0.98%，结果表明仪器精密度良好。

2.6.3 重复性试验 取S1 样品共6 份，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样测定，测5-HMF、原儿茶醛、原儿茶酸、紫云英苷含量，RSD 值分别为1.16%、2.26%、2.12%、1.28%，表明该方法的重复性良好。

2.6.4 稳定性试验 取混合对照品，分别于配制后0、2、5、10、15、24 h 进样测定，按“2.1”项色谱条件重复进样6 次，测得5-HMF、原儿茶醛、原儿茶酸、紫云英苷峰面积的RSD 值分别为1.29%、2.07%、1.18%、1.73%，结果表明样品稳定性良好。

2.6.5 加样回收率试验 取测定的S1 号狗脊样品粉末6 份各1.000 g，精密称定，分别加入等量的上述4 种有效成分混合对照品溶液，按“2.2.2”项制备供试液，按“2.1”项色谱条件进行测定，5-HMF、原儿茶酸、原儿茶醛、紫云英苷加样回收率分别为99.27%、98.21%、99.62%、101.18%，RSD 分别为0.84%、1.89%、0.48%、1.50%。

2.6.6 样品含量测定 根据“2.2.2”项下方法制备狗脊药材供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测得5-HMF、原儿茶醛、原儿茶酸、紫云英苷的含量，结果见表7。由结果可知，《中国药典》规定狗脊中的原儿茶酸应大于0.02%，16 批狗脊样品中原儿茶酸含量差异较大，部分样品中的原儿茶酸的含量尚未达到《中国药典》的标准。

表7 16 批狗脊4 种指标性成分含量测定结果Table 7 Content determination of four chemical components in 16 batches of C. barometz

3 讨论

《中国药典》2020 年版采用乙腈-1%醋酸作为流动相，本实验还考察了0.1%甲酸水-乙腈、0.05%磷酸水-乙腈、1%甲酸水-甲醇等流动相体系，在结合文献基础上对流动相进行优化[5-7]，结果发现以1%醋酸（A）-甲醇（B）为流动相梯度洗脱，样品的分离效果较好，最后采用1%醋酸-甲醇进行梯度洗脱。

中药材的内在质量受生长环境（海拔、土壤、水源、光照等）、采收时间以及加工方法、炮制方法等多方面影响。仅采用单成分或者多成分考察某种药材的质量，难以体现不同产地药材质量优劣，为了更好地区分产地对质量的影响，本实验运用相似度评价、聚类分析、PCA 分析和PLS-DA 的化学计量学方法对不同产地狗脊进行质量研究。聚类分析可知，9 个产地的狗脊样品可聚为2 类，其中广西狗脊聚为一类，其他产地狗脊聚为一类，说明产地的生态环境、气候条件等因素相关造成不同的差异性。在PCA 分析中可看出，9 个产地的狗脊样品可分成3 类，化学成分存在一定的差异，PCA 分析与聚类分析大致相同，说明广西来源的两个样品虽然通过聚类分析是一类，但是经过PCA 分析，仍可以将S1 和S2 区别开，可能与生长环境或者采收季节的原因有关。PLS-DA 分析也可以看出，广西2 个样品有所区别，广东和广西产地的3 个样品S1、S2和S8，分别偏离其他产地的样品。这两个产地的狗脊化学成分与其他产地的样品存在一定的差异。16批狗脊样品HPLC 指纹图谱，指认出10 个共有峰，其中《中国药典》2020 年版的狗脊以原儿茶酸为含量测定指标，说明以原儿茶酸具有特征性。本研究在此基础上，结合PCA 分析和PLS-DA 化学计量学方法，发现5-HMF、原儿茶醛、紫云英苷是产地的差异性特征有效成分，在考察狗脊质量时可以增加这些成分的考察。PCA 结合PLS-DA 结果分析，筛选出5-HMF、原儿茶醛、原儿茶酸、紫云英苷作为狗脊的有效成分。

5-HMF 具有广泛的药理活性，如抗氧化、抗炎、降血糖改善慢性炎症性疾病、阿尔茨海默病等，5-HMF 其本身不存在严重的健康风险，但其代谢产物5-磺甲基糠醛具有一定的毒副作用，如肾毒性、黏膜刺激、横纹肌损伤等，如何控制其转化以及控制一定的含量还需深入研究[8]。

通过文献调研发现，原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸[1]以及紫云英苷是狗脊发挥祛风湿、补肝肾、强腰膝功效的物质基础。原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸以及紫云英苷均为酚酸类成分。已经证实，原儿茶酸具有抗炎、镇痛、增强免疫力、修复缺血损伤、抑制血小板凝集等药理作用[9]。近年来，还有学者发现，原儿茶酸可减轻退变软骨细胞的损伤[10]。而原儿茶醛体现了更多活血化瘀类的作用，如扩张冠状动脉、抑制血小板聚集、抑制单核细胞趋化游走和趋化游走过程中产生的IL-8 活性等作用[11]。紫云英苷是黄酮类成分，黄酮类成分在治疗类风湿关节炎[12]、预防骨质疏松[13]以及抗缺血损伤、抗惊厥、抗痴呆等多种神经保护作用[14]。选取5-HMF、原儿茶酸、原儿茶醛、紫云英苷作为狗脊的有效成分不仅仅是化学模式识别的结果，也符合其祛风湿，补肝肾，强腰膝的作用机制。

本研究建立了16 批不同产地狗脊的HPLC 指纹图谱，确立了10 个共有峰，结合化学模式识别评价方法，在5 个已知化合物中筛选出了4 个影响狗脊质量的差异性标志物，并对这4 个成分进行了含量测定。本研究建立的HPLC 指纹图谱、化学模式识别方法以及含量测定方法稳定、可靠，为狗脊药材的质量控制和相关资源开发的深入研究奠定基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突