棘胸蛙腐皮病病原菌分离鉴定及五倍子水提液的治疗效果探究

徐 莉，黄其锻，陈友铃*，黄 镇，4*

(1.福建师范大学生命科学学院/福建省发育与神经生物学重点实验室,福建 福州 350117;2.福建省健丰生物科技有限公司,福建 泉州 362500; 3.福建省石冻王生物技术研发中心有限公司,福建 泉州 362500; 4.福建中医药大学,福建 福州 350117)

棘胸蛙Quasipaaspinosa隶属于两栖纲无尾目叉舌蛙科棘胸蛙属，主要分布于我国南方丘陵地区[1]。棘胸蛙肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，作为药食两用的新型养殖蛙类品种，受到了广大消费者的喜爱[2]。近年来，随着棘胸蛙的养殖规模和密度的增加，棘胸蛙疾病出现的类型、频率和严重性明显增加，其中影响较为严重的疾病之一就是腐皮病。腐皮病的病原种类较多，根据病因不同，腐皮病可分为营养型和病原型腐皮病。营养型腐皮病的主要病因是饲料单调，缺少多种维生素或微量元素而导致的皮肤溃烂，从而引发病菌感染。该种腐皮病可以通过增加维生素的方式进行治愈，对于棘胸蛙的致死率很低。而另一种病原型腐皮病的主要病因是由细菌直接引起，通常情况下在高密度养殖过程中发生，表现为初期棘胸蛙食欲减退、行动迟缓，表皮光泽度减退、脱落出现白斑，甚至指骨和颌骨外露，后期因伤口溃烂、病菌感染而逐渐死亡[3]。该病具有强传染性，几天时间可造成棘胸蛙的大量死亡，甚至全部死亡。在前人的研究中，发现了引起腐皮病的致病菌有多种，例如溃疡分枝杆菌Mycobacteriumulcerans[4]和斯氏分枝杆菌Mycobacteriumszulgai[5]可引起热带爪蟾Xenopustropicalis腐皮病；也有研究分析表明，棘胸蛙腐皮病可由嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila[3]、奇异变形杆菌Proteusmirabilis[6]、铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa[7]引起。在养殖过程中，该病的病原菌很难通过显微镜判定，导致在实际养殖中，养殖户滥用抗生素治疗该疾病，从而造成了其他病菌的耐药，因此需要进一步找到更绿色环保的治疗棘胸蛙腐皮病的措施。

随着人们的绿色健康养殖意识不断加强，对抗生素在动物疾病预防和养殖上产生的副作用也越来越关注。天然中草药是我国传统医学的重要组成部分，具有资源丰富、药效显著、可再生、对环境压力小等特点，随着对中草药功能和药理作用机制不断深入研究，中草药在动物养殖过程中的添加使用日益广泛。中草药五倍子Rhuschinensis具有敛肺降火、解毒止血、涩肠止泻、收湿敛疮等功效[8]，杨香玉等[9]也在研究中发现五倍子对痤疮致病细菌具有较强抑制作用，齐云云等[10]在研究中证实了五倍子中的双没食子酸与三-O-没食子酰基葡萄糖能有效促进大鼠溃疡面的愈合、减轻炎症。

因此，本研究将从患腐皮病棘胸蛙的病变组织中分离出病原菌，对其进行16S rRNA基因鉴定和药敏试验等研究，进一步设计五倍子水提液及抗生素药浴治疗方案，以期为棘胸蛙腐皮病的疾病防治、中草药合理利用以及棘胸蛙的健康养殖提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

患腐皮病棘胸蛙及正常健康棘胸蛙均由三明市某棘胸蛙养殖场提供。

1.2 试验方法

1.2.1患腐皮病棘胸蛙剖检及病原菌分离纯化 在无菌条件下取患病棘胸蛙的肝脏、肌肉、腐皮组织，使用手持研磨枪进行研磨，于超净工作台中分别取少量各组织研磨液涂布划线于不同固体脑心浸液肉汤培养基中，28℃恒温静置培养16 h后挑取单菌落进行后续试验。

1.2.2棘胸蛙腐皮病病原菌鉴定 将挑取的单菌落分别溶于10 μL无菌双蒸水中制成菌悬液，吸取8 μL菌悬液入液体培养基内扩增后保菌，吸取剩余2 μL作为DNA模板加入PCR体系，使用细菌16S rRNA基因的通用引物[11]F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′)扩增基因片段，将扩增后的PCR产物送生物公司测序，最终得到10株单菌落的16S rRNA基因的测序结果，将得到的各菌落基因序列从JXW01连续编号至JXW10，各测序结果序列通过NCBI的BLAST检索序列同源性分析，使用MEGA软件，采用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)[12]构建系统发育树，进行菌株的鉴定。

1.2.3五倍子水提液制备及棘胸蛙腐皮病病原菌药敏试验

1.2.3.1五倍子水提液的制备 精确称取10 g五倍子粉末于锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水，浸泡30 min，煮沸20 min后纱布过滤，剩下的药渣加入50 mL蒸馏水，煎煮15 min过滤。合并两次的滤液，重新导入干净锥形瓶中，加热煮沸浓缩至10 mL，此时五倍子水提液的浓度为1 g·mL-1。灭菌后，于4℃冰箱内存放备用。

1.2.3.2棘胸蛙腐皮病病原菌药敏试验 根据农业农村部发布的《水产养殖用药明白纸(2022年1号、2022年2号)》筛选出常见治疗药物，一共11种抗生素，分别为：甲砜霉素、氟苯尼考、氟甲喹、恩诺沙星、维生素C磷酸酯镁盐酸环丙沙星、硫酸新霉素、磺胺间甲氧嘧啶片、磺胺嘧啶片、磺胺二甲嘧啶、复方新诺明、强力霉素。按照最小用药单位将各类抗生素及五倍子水提液制成药敏纸片。根据k-b纸片扩散法[13]，将分离到的致病菌于脑心浸液肉汤液体培养液中，28℃下震荡培养24 h，根据麦氏比浊法调整菌浓度为0.5麦氏浓度后，均匀涂布于固体培养基中，将药敏纸片均匀放置其中。培养16 h后，观察各抑菌圈大小。根据各抑菌圈直径大小判断敏感性，抑菌圈直径d>20 mm 判定为高度敏感，表示为“S”；10 mm

1.2.4患腐皮病棘胸蛙治疗试验 本研究前期对于棘胸蛙腐皮病的治疗进行了调研，总结出养殖户使用五倍子进行腐皮病的治疗是一个有效的经验方法。为进一步验证五倍子对于棘胸蛙腐皮病的治疗效果，采用五倍子水提液，并根据药敏试验结果挑选了2种抗生素，设计了硫酸新霉素、恩诺沙星、五倍子水提液的药浴治疗试验。

整个治疗试验周期为20 d，将患病棘胸蛙分为4组，每组3只，A组为五倍子水提液治疗组，每天换水1 L后加入100 μL五倍子水提液，每治疗3 d休药1 d；B组为硫酸新霉素治疗组，每天换水1 L后加入1 mL硫酸新霉素药液浸泡1 h；C组为恩诺沙星治疗组，每天换水1 L后加入1 mL恩诺沙星药液；D组为患病对照组，每天换水1 L后不做任何处理。另外设置一组3只健康棘胸蛙的健康对照组，每天换水1 L后不做任何处理。

2 结果与分析

2.1 患腐皮病棘胸蛙组织剖检观察

患腐皮病棘胸蛙的临床症状与解剖学观察见图1，病蛙外观主要症状为体色较深，眼部浑浊，腿部伴有红腿症状，体表四肢关节处、吻部、额部出现不同大小不规则溃烂，溃烂处肌肉红肿，重症者深达骨骼。解剖后，病蛙内部肝脏膨大呈红棕色并出现一定量的花斑，胆、肠道、心脏未见异常。

注：A为腿部溃烂；B为吻部溃烂，眼部泛白；C为腹部溃烂；D为肝脏膨大出现花斑。

2.2 棘胸蛙腐皮病病原菌的分离纯化与鉴定

从患腐皮病的棘胸蛙中选取肝脏、肌肉和腐皮组织进行病原菌的分离，然后从中挑选10个细菌单菌落通过16S rRNA序列进行鉴定，将得到的10株细菌的16S rRNA测序结果进行BLAST比对分析，用MEGA软件构建系统发育树(图2)。结果显示菌株JXW01、JXW02、JXW03、JXW04、JXW05与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的同源关系最近；菌株JXW06、JXW07、JXW08、JXW09、JXW10与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的亲缘关系最近。因此，从结果可以分析得出，此患腐皮病的棘胸蛙主要病原菌为嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌。

图2 基于16S rRNA序列的进化树鉴定棘胸蛙病原菌

2.3 分离到的棘胸蛙腐皮病病原菌的药敏试验结果

由表1可知，嗜水气单胞菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、氟甲喹等7种药物高度敏感，对五倍子水提液、磺胺二甲嘧啶等3种药物中度敏感，对复方新诺明、磺胺嘧啶2种药物耐药；维氏气单胞菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、强力霉素等9种药物高度敏感，对五倍子水提液、氟甲喹2种药物中度敏感，对磺胺嘧啶片耐药。2种病原菌均对其高度敏感的药物有7种，分别为：甲砜霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、维生素C磷酸酯镁盐酸环丙沙星、硫酸新霉素、强力霉素。

表1 病原菌的药敏试验结果

2.4 患腐皮病棘胸蛙的药物治疗试验结果

由表2可知，健康蛙对照组的棘胸蛙20 d内均未死亡；硫酸新霉素治疗组用药第15 d后棘胸蛙均未存活，存活率为0%，与患病对照组情况相同；恩诺沙星治疗组棘胸蛙在用药后第20 d后存活1只，存活率为33.3%；五倍子水提液治疗组棘胸蛙在用药后均存活，存活率为100%。

表2 腐皮病棘胸蛙治疗试验结果

五倍子水提液治疗组在棘胸蛙均存活的前提下，对棘胸蛙腐皮病症状的治愈效果最好，五倍子水提液治疗组棘胸蛙患处前后对照见图3。

注：A为第0 d腐皮病棘胸蛙患处；B为第7 d腐皮病棘胸蛙患处；C为第15 d腐皮病棘胸蛙患处；D为第20 d腐皮病棘胸蛙患处。

3 讨论与结论

棘胸蛙腐皮病是棘胸蛙养殖过程中的一种常见的细菌性疾病，大量研究证据表明蛙的死亡是由于细菌感染引起的器官组织炎症。在本试验中，患该病的棘胸蛙病症主要表现是身体多部位溃烂，肝脏部位肿大，出现花斑，这与已有的报道[3，7，14]一致。已有的研究表明引起蛙类腐皮病的病原菌有很多种，戚建华等[15]发现布韦不动杆菌Acinetobacterbuvestris能引起牛蛙腐皮病；舒新华等[16]发现奇异变形杆菌也能独立引起牛蛙的腐皮病；肖波[3]的研究证实引起棘胸蛙腐皮病的致病菌是嗜水气单胞菌。本研究中从病蛙身上分离出了嗜水气单胞菌与维氏气单胞菌，嗜水气单胞菌为棘胸蛙腐皮病的致病菌这与肖波[3]的研究结果相似，虽然维氏气单胞菌在蛙类中引起腐皮病的病例尚未见报道，但在金鱼Carassiusauratus[17]以及中国大鲵Andriasdavidianus[18]等养殖动物中曾被反复证实是引起腐皮病及败血症的主要致病菌。说明细菌性疾病具有“一病多因，一因多病”的特点，嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌等都能引起腐皮病的发生，而同一种腐皮病，也有可能是因为不同的致病菌引起。因此在蛙类细菌性疾病治疗的过程中，要明确疾病的主要致病菌，针对性用药，不能仅凭主观判断盲目用药，耽误病情，进而影响养殖的经济效益。

本研究结果表明嗜水气单胞菌对7种药物高度敏感，2种药物耐药；维氏气单胞菌对9种药物高度敏感，1种药物耐药。硫酸新霉素与恩诺沙星是病原菌敏感性最高的两种药物，但在实际治疗中效果不佳，硫酸新霉素治疗组存活率为0%，恩诺沙星治疗组存活率为33.33%，推测可能与不同宿主来源、研究样本数量及地域分布等因素有关，因此硫酸新霉素与恩诺沙星的治疗方案还需进一步探究。在药敏试验中两种病原菌对五倍子水提液仅为中度敏感，但在实际治疗中，五倍子水提液治疗组存活率为100%，且患处得到明显改善，腐烂伤口逐渐愈合，这表明五倍子水提液可有效控制与治疗棘胸蛙的腐皮病，推测五倍子水提液不仅具有抑菌作用，还具有免疫方面的功能。相关文献也表明五倍子除了拥有体外抑菌效果[19-21]之外，还含有大量的鞣质以及五倍子酸，其中鞣质成分含量非常丰富，具有诸多功效，能够抗菌消炎、抗氧化、诱导细胞凋亡，同时其毒性较小，能够广泛用于医药、食品等领域[22]。还有研究表明五倍子中的鞣质可以通过ERK1/2介导的信号通路有效促进伤口愈合，显著增加细胞数量和迁移，减少细胞死亡和乳酸脱氢酶的释放，以及诱导Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA过度表达，增加胶原蛋白的总溶解度，并激活潜在的抗氧化特性，从而加速伤口愈合[23]。目前对五倍子治疗蛙类疾病的研究主要集中在药敏试验和药理方面，缺少五倍子在实际蛙类细菌性疾病中治疗的研究报道，本研究提供了五倍子水提液在实际蛙类疾病中的治疗效果，为棘胸蛙腐皮病的实际治疗提供了一种参考方案。

在棘胸蛙腐皮病的实际预防治疗中，建议养殖户采取预防为主的理念，在养殖初期，运输、放苗时应小心操作，注意防止蛙体剐蹭，做好蛙池的平整度检查工作，防止有尖锐凸起划伤蛙体；在日常的养殖活动中，及时清理蛙池，定期定时进行消毒，加强水体质量检测，保持水质干净合格；由于棘胸蛙性格上胆小易受惊，在日常工作中应保持环境的安静与湿润；疾病高发季节，应适当在日常饲料中添加一些矿物质和微量元素，例如蛙多维等，防治营养性腐皮病的发生；在发病初期，应及时隔离病蛙与正常蛙，观察病蛙具体病症，明确病蛙主要致病菌，针对性进行药物治疗。