基于数据挖掘及网络药理学分析新安医家治疗哮喘的用药规律及作用机制

王 婷 ，汪 洋 ，董 鹏，尚莉丽

（1.安徽中医药大学 研究生院，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学第一附属医院 儿科，安徽 合肥 230031）

新安医学以古徽州文化为土壤，以儒学、新安理学、新安朴学等传统文化为源泉，在“不为良相，即为良医”的思想引导下诞生了诸多名医大家，创造了大量具有科学价值的学术思想，编纂了诸多医学专著，为后世医家所延用。哮喘为临床难治病之一，中医属“哮证”“喘证”的范畴，主要表现为反复咳喘、胸闷、呼吸困难等。本研究从新安医家著作入手，通过数据挖掘技术对与哮喘相关处方进行系统的梳理并发掘核心处方，利用网络药理学对核心处方进行分析，探索新安医家治疗哮喘的用药规律及潜在作用机制，以期为临床治疗提供参考。

1 一般资料

1.1 资料来源

数据源自24 本新安医学专著，具体如下：《石山医案》《医方考》《名医类案》《证治方药》《医宗金鉴》《医学心悟》《临证指南医案》《不居集》《生生子医案》《薛生白医案》《程杏轩医案》《医灯续焰》《叶天士医案》《叶氏医案存真》《眉寿堂方案选存》《叶氏晚年医案存真》《续名医类案》《松崖医径》《丹台玉案》《王任之医案》《王仲奇医案》《医验录》《程茂先医案》《程门雪医案》。

1.2 检索策略

针对哮喘病因病机、常见临床症状以及相关体征，以“哮病”“咳喘”“喘息”“喘逆”“喘鸣”“哮吼”“呷嗽”“上气”“哽气”“水鸡声”为关键词进行检索。

1.3 纳入标准

（1）新安医家著作；（2）具有完整药物组成者；（3）各种剂型均可纳入；（4）取首诊及二诊、三诊处方；（5）同一处方只纳入一次；（6）处方相似但药物个数相差≥3味者均纳入，不足者取药物多者纳入。

1.4 排除标准

（1）无具体药物组成者；（2）药物组成＜2 味者；（3）合并其他疾病者；（4）处方疗效不明确或无效者；（5）处方重复者。

1.5 数据录入及预处理

本研究采用三人录入模式，以2020 年版《中国药典》[1]、《中医药大辞典》[2]、《中华本草》[3]为参考，对中药进行规范化命名。当炮制方法、用药部位等不同时，对功效影响较小者应规范为同一名称（如：“炙甘草”“炙麻黄”统一命名为“甘草”“麻黄”），差异较大者则分别录入（如：“生地”“熟地”分别命名为“地黄”“熟地黄”）。两人将规范后的数据录入，建立新安医学哮喘数据库，另一人进行核对，确保数据的真实性与准确性。

1.6 数据挖掘分析

（1）频数统计：利用Excel 2016 软件对中药频数、性味归经、用药类别进行统计分析。（2）关联规则分析：利用IBM SPSS Modeler 18.0 软件，选取Apriori 算法，进行关联规则分析，获得新安医家治疗哮喘的核心药对。（3）聚类分析：采用SPSS 23.0 软件对数据进行聚类分析，发掘新安医家治疗哮喘的药物组合。（4）复杂网络可视化分析：利用Cytoscape 3.9.1软件对关联规则分析所获得的链接进行复杂网络分析，发掘核心处方。

1.7 网络药理学分析

（1）有效成分筛选：通过TCMSP 数据库(http: //tcmspw.com / tcmsp.Php)检索核心处方药物，按照口服利用度（OB）、类药性（DL）筛选出核心处方有效成分。（2）药物靶点预测：通过TCMSP 数据库获取活性成分对应靶点。未找到明确靶点者，使用Pubchem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获得简化分子线性输入规范并将其输入Swiss Target 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch）获得相应靶点，并将其输入Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org），选取“人类”为研究对象，进行标准化命名，合并去重后获得核心处方总靶点。（3）疾病靶点预测：以“asthma”为关键词利用OMIM 数据库（https://omim.org）、Genecard数据库（https://www.genecards.org）、disGENET 数据库（https://www.disgenet.org）进行检索，将所有数据库所得疾病靶点整合去重，获得哮喘相关基因。（4）哮喘-药物交集靶点：将疾病、药物靶点依次输入Venny 2.1.0网站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）获取交集靶点。（5）PPI 分析：将交集靶点输入STRING 数据库（https://cn.string-db.org),获得哮喘-药物PPI 关系，通过Cytoscape 3.9.1 进行可视化升级并筛选出核心靶点。（6）功能富集分析：将交集靶点输入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov）进行富集分析，并利用微生信网站（http://www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化展示。

2 结果

2.1 新安医家治疗哮喘用药规律分析

2.1.1 中药频次分析 在237 条处方中共出现药物220 种，总用药频次达1 919 次，使用最多者为甘草，达101 次，使用频率为5.26%（频率 = 频次/总用药频数），置信度达42.62%（置信度=频次/处方数），使用频次前30 名的药物情况见表1。

表1 药物频数表Tab.1 Drug frequency table

2.1.2 药性分析 在所涉及220 味药中药性以温、寒、平性药多见，分别为65、50、40 次，约占所有药物的29.55%、22.73%、18.18%。见表2。

表2 中药药性统计表Tab.2 Statistical table of of drug property distribution of Chinese medicine

2.1.3 药味分析 在此220 味中药中药味以甘、辛、苦为主，分别出现96、89、80 次，约占从总药味频次的27.99%、25.95%、23.32%。见表3。

表3 中药药味统计表Tab.3 Statistical table of Chinese medicine taste distribution

2.1.4 药物归经分析 该220 味中药以归肺经者最多，共使用了112 次，其次为脾经、胃经，各使用了84、79 次。见图1。

图1 中药归经分布雷达图Fig.1 Radar chart of meridian tropism distribution of traditional Chinese medicine

2.1.5 药物类别分布 通过药物类别分析可知，补虚药数量最多，其次为清热药、止咳化痰平喘药，分别占35、27 和27 味。见表4。

表4 中药功效分类统计表Tab.4 Statistical table of efficacy classification of traditional Chinese medicine

2.1.6 关联规则分析 将规范化处理后的数据整理成矩阵的形式，并输入IBM SPSS Modeler 18.0 软件，利用Aprior 算法创建关联规则模型，当支持度≥10%、置信度≥70%[4]时，可得出二项关联规则5 项。见表5。

表5 药物二项关联规则分布（支持度≥10%，置信度≥70%）Tab.5 Distribution of drug binomial association rules （support ≥10%,confidence ≥70%)

2.1.7 聚类分析 对规范化处理后的药物，按使用频次降序排列，将前30 味常用药物输入SPSS 23.0软件，以欧式距离为距离类型，最长距离法为聚类方法进行聚类分析并绘制谱系图，具体见图2。结合中医基础及临床使用情况，以距离17 为界获得以下8个聚类组，分别为：C1: 款冬花、紫苑、百部、葶苈子、紫苏子、薏苡仁；C2:苦杏仁、麻黄、干姜、桂枝；C3:半夏、橘红；C4:人参、黄芪、五味子、麦冬；C5：白芍、当归、白术、黄芩；C6:生姜、大枣、甘草；C7:陈皮、紫苏叶、桔梗；C8:桑白皮、浙贝母。

图2 高频药物聚类分析图Fig.2 High-frequency drug clustering analysis diagram

2.1.8 复杂网络可视化分析 将关联规则分析所得出的链接数据导入Cytoscape 3.9.1 软件进行药物网络可视化分析，其中，节点即药物，节点越大、颜色越深则该药物在本病的治疗中越重要。线则为药物与药物之间的链接，连线越粗表示药物间同时出现的概率越高。Degree 值为节点的度中心性，Degree 值越大，药物与本病的关联性越大。结果显示，茯苓、甘草、苦杏仁、人参、五味子、半夏、紫苏子、桑白皮、麻黄、生姜、陈皮等11 味药节点最大、颜色最深、连线最多，与本病的关联性最大，属核心药物，并视此为新安医家治疗哮喘的核心处方，见图3。

2.2 核心处方治疗哮喘作用机制分析

2.2.1 成分及靶点筛选 根据核心处方药物分别输入TCMSP 数据库，当生物利用度(OB)≥30%，类药性（DL）≥0.18 时[5]，获得茯苓、苦杏仁、人参、五味子、半夏、紫苏子、桑白皮、麻黄、陈皮、生姜、甘草的有效成分分别为15、19、22、21、13、16、32、23、10、5、92 个。合并去重后获得总活性成分228 个。通过TCMSP、Swiss Target 数据库，获得活性成分对应靶点，输入Uniprot 数据库，以“人类”为研究对象进行标准化命名，合并去重后获得到总靶点730 个。

2.2.2 疾病靶点预测 分别通过OMIM、GeneCard、Disgenet 数据库，以“asthma”为关键词进行检索，分别获得相关靶点44、7 896、2 096 个，按照Score ≥3 次中位数筛选后获得疾病相关靶点1 089 个，并输入Uniprot 数据库进行标准化矫正。

2.2.3 哮喘-药物交集靶点 将药物及哮喘靶点分别输入Venn 2.1.0 网站获得交集靶点229 个，并绘制韦恩图，见图4。

图4 哮喘-药物交集基因Venn 图Fig.4 Venn diagram of asthma-drug intersection gene

2.2.4 PPI 分析 将229 个交集靶点输入STRING数据库，获得交集靶点的PPI 互作网络，将其输入Cytoscape 3.9.1 软件进行可视化升级，见图5。利用Cytoscape 软件插件cytoHubba 利用MMC 算法对其进行拓扑分析，获得相关性最高的10 个为核心基因，分别为：STAT3、TNF、IL-6、IL-1B、IL-10、CCL2、CXCL8、ICAM1、IL-4、IL-2，见图6。

图5 哮喘-药物PPI 网络图Fig.5 Asthma-drug PPI network diagram

图6 MCC 提取核心基因图Fig.6 Core gene map extracted by MCC

2.2.5 功能富集分析 将哮喘-药物交集靶点输入DAVID 数据库获得GO 功能富集结果1 296 条（BP 1 018 个、CC 87 个、MF 191 个），KEGG 通路富集分析获得通路171 条，按P 值排序，筛选前20 项输入微生信平台进行可视化展示，见图7、8。其中，BP（生物学过程）有炎症反应、脂多糖应答、药物应答、胞浆钙离子浓度的正调控、细胞衰老等，CC（细胞组分）有质膜、受体复合体、局部粘着斑激酶、神经元细胞体、胞液等，MF（分子功能）有酶结合、蛋白结合、转录因子结合、蛋白酪氨酸激酶活性、细胞因子活性等。KEGG 通路包括Th17 细胞分化途径、IL-17 信号通路、钙信号通路、TNF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路等。

图7 GO 功能富集分析柱状图Fig.7 Histogram of GO function enrichment analysis

图8 KEGG 通路富集分析气泡图Fig.8 Bubble diagram for KEGG pathway enrichment analysis

3 讨论

中医学认为，哮喘的发生是内外因相互作用的结果，主要由外感六淫时邪、情志异常、嗜食甜酸咸腥、体虚劳倦等内外因素，触动内伏之痰饮，相互搏结，壅滞气道，肺失宣肃所致。认为哮喘病位总属于肺，与五脏密切相关，药物分析可知新安医家治疗哮喘多用补虚药、清热药、化痰止咳平喘药，药性以温性、寒性为主，药味以甘、辛、苦为先，此多与哮喘发生之内外因以及病理因素相符合，体现了新安医家标本兼治的学术思想。归经分析得出，主要归肺、脾、胃、肾，与哮喘的病位相合，肺属金，脾属土，咳喘日久，肺气耗伤，子盗母气，脾胃虚损。肾与脾，先后天相互资生，肺脾胃肾经药物相互为用，体现了新安医家培土生金、固本培元的学术思想。新安医家认为，哮喘“内有壅塞之气，外有非时之感，膈有胶固之痰”[6]，治疗当注重调畅气机，化痰祛瘀。半夏-橘红为二陈汤之核心，为治痰之常用药对；苦杏仁-紫苑开肺通腑，麻黄-苦杏仁宣降相宜，均有调畅气机之功；杏仁-款冬花止咳化痰；薏苡仁-苦杏仁宣上利下，肺脾同调，行气利水，从源头抑制痰的产生。聚类分析主要将新安医家治疗哮喘用药聚为8 类，聚一类、聚三类、聚七类、聚八类侧重行气止咳化痰，主要针对哮喘咳喘、痰多之外在表现。聚二类为临床治疗哮喘的常用方小青龙汤核心药物，具有抗过敏、抗炎、止咳平喘之功[7]。聚四类为生脉散加黄芪，《医学源启》云：“麦门冬……治肺中伏火，脉气欲绝。加五味子、人参二味为生脉散，补肺中元气不足”[8]。黄芪具有补益肺脾之气，固护肌表之功[9]，主要针对哮喘本虚之性。聚五类酸收相配，养血活血，主要针对哮喘气滞日久化瘀之性。聚六类有佐使之功，擅助各类药物调和脾胃、补益气血、扶正祛邪[10]。以上均表明，新安医家治疗哮喘时注重对气的调控，重视“痰”“瘀”在哮喘中的作用。

由复杂网络可视化分析得出，新安医家治疗哮喘核心处方为：茯苓、甘草、苦杏仁、人参、五味子、半夏、紫苏子、桑白皮、麻黄、生姜、陈皮。此方以华盖散为依托，方中麻黄发汗散寒、宣肺化痰为君，臣以降气止咳化痰之苦杏仁、紫苏子，宣降得宜，共奏降气止咳化痰之功，暗合哮喘痰饮内伏，肺气上逆之病机，佐以茯苓健脾渗湿，生姜辛温通阳、宣散痰湿，桑白皮泻肺平喘、利水消肿，陈皮理气健脾、半夏燥湿化痰，人参大补元气、补益肺脾，气顺则痰自除，痰除则气下，与哮喘“内有壅滞之气，膈有胶固之痰”之特性相符。哮喘肺脾本虚，纯用温燥之品恐有耗气伤津之虞，故以五味子上能敛肺气，下能资肾阴，与人参合用，使气阴两复，肺润津生，亦为佐药。甘草益气补中、化痰止咳、调和诸药应为佐使。诸药同用，升降相宜，散收有序，共奏健脾益气、止咳化痰、行气平喘之功。

西医认为，哮喘是多种细胞、细胞因子以及细胞组分相互作用的结果[11]，由网络药理学结果可知，核心药物对哮喘的作用是从多靶点、多路径产生的，且多与气道炎症以及气道重塑相关。IL-2、IL-4、IL-6、TNF、CCL2 为重要的促炎因子，通过破坏Th1/Th2 平衡、细胞与细胞间相互作用、介导单核细胞、巨噬细胞炎症部位迁移等途径诱发或加重气道炎症，与哮喘的严重程度成正相关[12-14]。而CCL2、IL-10、STAT3 具有减少促炎介质分泌、抑制自身免疫、介导白细胞向炎症部位迁移等作用[15-16]，对哮喘气道炎症的发生具有保护作用。IL-1B、CXCL8、ICAM-1 参与嗜酸性粒细胞迁移、聚集、脱颗粒等过程，可促进哮喘气道重塑的发生[17-19]，对哮喘患者肺功能产生不良影响。核心处方主要通过Th17 细胞分化途径、钙信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt 信号通路等多种路径治疗哮喘。IL-17 信号通路与Th17 细胞分化信号通路为上下游关系，现已证明Th17 细胞分化在哮喘的发病机制中占据重要地位[20]。气管平滑肌收缩特性的变化和平滑肌质量增加的是导致气道高反应性和重塑的主要因素[21]，而钙离子信号是维持气道平滑肌功能重要因素，在哮喘的治疗中存在重要意义。TNF 信号通路与哮喘发病最重要的通路之一，可通过激活NF-κB、MAPK 信号通路发挥作用，参与哮喘气道重塑、气道高反应性以及慢性炎症的各个过程[22]。PI3K-Akt 信号通路在炎症募集、调节炎症介质的表达以及慢性炎症呼吸性疾病的气道重塑、免疫细胞功能和皮质醇不敏感方面起着重要的作用[23]，是治疗哮喘最经典的通路之一。

4 结论

新安医家用药多从炎症反应、气道重塑等角度治疗哮喘，注重标本从治，尤为侧重对气的调控，强调治“痰”“瘀”的重要性，用药针对性强，结合病因病机随证辅以解表、补虚、行气、化痰、活血之法，体现了新安医家“标本兼顾”“培土生金”“固本培元”的学术思想，为临床医疗提供了参考。