基于ICP-MS 技术分析不同产地鳖血无机元素差异

梁艺瑶，苏雪蓉，娄 悦，谢 颖，崔小兵，李 锦，赵晓莉*

（1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023；2.江苏省中医院 药学部，江苏 南京 210004）

鳖科动物中华鳖Trionyx sinensisWiegmann 是我国传统的水产动物，全身营养丰富，可作药食两用。鳖血来源于中华鳖的新鲜血液，味咸、性寒，具有滋阴清热、活血通络之功效[1]。现代研究表明，鳖血含有蛋白质、氨基酸、无机元素、酶类等活性物质，具有调节免疫及抗肿瘤等药理活性[2-4]。鳖血作为中药炮制的传统辅料应用历史悠久，主要用于银柴胡、丹参、柴胡等饮片的炮制，有填血滋阴、抑制药物浮阳之性，增强清肝退热之效[5]。以鳖血拌银柴胡，增强滋阴退热除蒸之力[6]；以鳖血炮制丹参，增其清心养阴除烦之效[7]；以鳖血拌柴胡，防柴胡辛凉升散耗散肝阴[8]。

中华鳖在中国主要分布于湖南、江苏、浙江等地，以人工养殖为主[9]。不同养殖地的土壤、水源、气温等因素可能会影响鳖血的无机元素含量。研究表明，鳖血中含有18 种无机元素，除了K、Na、Ca、Mg、P 等常量元素外，还含有人体必需的Fe、Zn、Cu、Mn 等微量元素，这些微量元素可促进激素合成，影响机体的生长发育，减少疾病的发生[8]。鳖血作为炮制辅料，其无机元素的含量会进一步影响炮制品的药效[10]，目前尚未见有关鳖血无机元素的分布规律相关研究。

常用的无机元素分析方法有电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法、原子吸收分光光度法、紫外-可见分光光度法等[11-12]。ICP-MS 灵敏度高、检出限低、线性范围宽，可快速、准确地检测人血液中的十几种元素[13]。由于鳖血取血量少，元素含量低，本研究选择ICP-MS 测定不同产地鳖血中的18 种无机元素，并采用聚类分析和主成分分析方法进行多元统计分析，以期为鳖血的质量评价、安全性评价及综合利用提供依据。

1 材料

1.1 主要仪器

OptimaTM 2100DV 型电感耦合等离子体-质谱仪（ICP-MS，美国Perkin Elmer）；MS-105 型十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo）。

1.2 药品与试剂

硝酸（批号：20141119，优级纯）、30% H2O2（批号：20141128，优级纯）均购自国药集团化学试剂有限公司；多元素标准溶液（批号：GNM-M248430，100 mg/L）、混合内标溶液［钪（Sc）、锗（Ge）、铋（Bi）、铟（In）］（批号：GNM-M041207，100 μg/mL）均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；实验用水为屈臣氏蒸馏水。

12 批中华鳖经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为鳖科动物中华鳖Trionyx sinensisWiegmann，产地为江苏省宝应县、浙江省淳安县、湖南省汉寿县、浙江省余姚市。经断颈法取血后，置于CPDA-1 血液保存液中，于4 ℃条件下贮藏，备用。鳖血样品信息见表1。

表1 样品来源信息Tab.1 Sample source information

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密量取适量混合内标溶液，用3% HNO3稀释成浓度为100 μg/L 的内标溶液。精密量取多元素混合标准溶液，以3% HNO3配制成浓度分别为0、1、5、10、20、50、100、250、500 μg/L 的系列多元素混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取鳖血0.2 g，精密称定，加入浓硝酸3 mL，30% H2O22 mL，消解12 h 至样品澄清透明，加蒸馏水定容至500 mL。离心5 min（15 000 r/min），取上清液，备用。同法制备空白溶液。

2.3 ICP-MS 工作条件

高频等离子体发射功率：1 500 W；检测器电压：1 700 V；载气：高纯氩气；等离子体气体积流量：17 000 mL/min；雾化气体积流量：0.92 mL/min；碰撞气体积流量：1.2 mL/min，引入内标溶液进行检测。

2.4 方法学考察

2.4.1 工作曲线的制备及检出限的测定 取“2.1”项下多元素混合对照品溶液在“2.3”项条件下进行测定，以各元素浓度（X，μg/L）为横坐标，相应仪器响应值与内标测量值的比值（Y）为纵坐标，绘制工作曲线。取空白溶液，按“2.3”项下条件测定11次，以测定元素的信号响应值的标准偏差（δ）的3倍所对应的质量浓度为检测限。线性回归方程、相关系数（r）、线性范围及检测限见表2。

表2 18 种元素的线性回归方程、相关系数、线性范围及检测限Tab.2 Regression equation, correlation coefficient, linear range and LOD of 18 elements

2.4.2 精密度试验 取“2.1”项下配制的浓度为100 μg/L 的多元素混合对照品溶液，按照“2.3”项下条件连续进样6 次，各元素质量分数的RSD 为0.55% ～ 4.21%，表明仪器具有良好的精密度。

2.4.3 稳定性试验 取批号为BY1 的样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0、0.5、1、2、3、4 h，按照“2.3”项下条件进样测定，各元素质量分数的RSD 为1.76% ～ 9.22%，表明该方法稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取批号为BY1 的样品，按照“2.2”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按照“2.3”项下条件分别进样测定，各元素含量的RSD为0.14% ～ 9.15%，表明该方法重复性较好。

2.4.5 加样回收率试验 取批号为BY1的样品0.1 g，精密称定，加入适量已知浓度的混合多元素对照品溶液，按“2.2”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.3”项下条件分别进样测定，各元素含量的回收率范围为86.67% ～ 107.33%，表明该方法基本不受样品基质干扰，准确度良好。

2.5 鳖血无机元素的分析

各取12 批鳖血样品0.2 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下条件进行测定，计算各元素含量。12 批不同产地的鳖血样品中Na 元素含量最高，其次为P、K、Fe、Mg 等元素，见表3。

表3 12 批不同产地鳖血无机元素含量（μg/g, n = 3）Tab.3 Contents of inorganic elements in 12 batches of Sanguis Trionycis from different producing areas（μg/g, n = 3）

2.6 无机元素特征图谱分析

根据12 批鳖血中无机元素测定结果，采用GraphPad Prism 9 绘制鳖血无机元素特征图谱（图1）。为充分体现各元素贡献，将所有元素扩大或缩小至同一数量级，即Cu、Mn、V、Ni、Sr、Sn 保持不变，Pb、As、Zn 扩大10 倍，Co 扩大5 倍，P、K、Fe 缩小100 倍，Mg、Ca、Zn、Si 缩小10 倍，Na 缩小1 000 倍。结果表明，四个产地鳖血无机元素整体特征基本一致，含量存在差异，这可能与不同中华鳖养殖基地的土壤、水质、温度等有关。

图1 四种产地鳖血的无机元素特征图谱Fig.1 Characteristic spectra of inorganic elements in Sanguis Trionycis from four producing areas

2.7 聚类分析和主成分分析

2.7.1 聚类分析 采用IBM-SPSS 26 软件，以12批鳖血中的18 种无机元素含量作为聚类变量，进行聚类分析，得系统聚类树状图（图2）。判别距离为15 时，12 批样品被分为四类，BY1、BY2、BY4 聚为一类，BY3 聚为一类，HS1、HS2、HS3 聚为一类，YY1、YY2、CA1、CA2、CA3 聚为一类，即浙江省收集的鳖血聚为一类，可与湖南省和江苏省两地区分，表明不同产地鳖血的无机元素富集存在一定特征。

图2 聚类分析谱系图Fig.2 Cluster analysis pedigree diagram

2.7.2 主成分分析 采用IBM-SPSS 26 软件对12批鳖血样品中各元素含量数据进行标准化处理，进行主成分分析，主成分分析的特征值及方差贡献率结果见表4。前4 个主成分的特征值分别为9.559、3.675、1.809、1.229，均大于1，方差贡献率分别为53.10%、20.42%、10.05%、6.83%，表明这4 个成分能够代表鳖血中绝大多数无机元素信息（图3），因此，对前4 个成分的载荷矩阵进行深入分析。由表5 可知，第1 个主成分与Co、V、Fe、K、Sr 高度相关（相关系数＞0.9），第2 个主成分与Mn 呈正相关（相关系数＞0.9），第3 个主成分与Sn 呈正相关（相关系数＞0.8），第4 个主成分与Na 呈正相关（相关系数＞0.5）。前4 个主成分的累计方差贡献率为90.40%，超过总方差的90%，因此Co、V、Fe、K、Sr、Mn、Sn、Na 被认为是鳖血的特征元素。

图3 元素主成分载荷图Fig.3 Element principal component load diagram

表4 鳖血主成分特征值及方差贡献率Tab.4 Principal component characteristic values and variance contribution rate of Sanguis Trionycis

表5 鳖血主成分因子载荷矩阵Tab.5 Loading matrix of principal component factors of Sanguis Trionycis

以选取的主成分方差贡献率为权重系数，以因子载荷值除以方差特征值开平方得到4 个主成分得分公式，分别为F1=0.317Z1-0.315Z2-0.310Z3-0.309Z4+0.308Z5+0.302Z6-0.290Z7-0.240Z8-0.213Z9-0.210Z10+0.204Z11+0.204Z12+0.051Z13+0.161Z14+0.206Z15+0.096Z16-0.003Z17+0.166Z18；F2=-0.008Z1+0.017Z2+0.043Z3+0.073Z4+0.142Z5-0.094Z6+0.073Z7+0.300Z8+0.195Z9-0.248Z10+0.214Z11-0.213Z12+0.476Z13+0.411Z14+0.370Z15+0.362Z16-0.088Z17+0.077Z18；F3=0.008Z1+0.146Z2-0.058Z3-0.010Z4-0.074Z5+0.144Z6+0.127Z7-0.118Z8+0.126Z9-0.025Z10+0.169Z11+0.357Z12+0.106Z13+0.121Z14+0.101Z15+0.249Z16+0.621Z17-0.513Z18；F4=0.142Z1-0.029Z2+0.158Z3+0.203Z4-0.052Z5+0.039Z6+0.234Z7+0.069Z8-0.209Z9+0.522Z10-0.253Z11-0.210Z12+0.090Z13+0.033Z14-0.090Z15+0.311Z16+0.388Z17+0.399Z18。 其 中，F1～F4为4 个主成分的得分，Z1～Z18为P、K、Na、Mg、Ca、Fe、Cu、Zn、Co、Mn、Si、V、Ni、Sr、Pb、As、Sn、Li 元素的标准化数据。按照公式F=0.531F1+0.204F2+0.101F3+0.683F4计算综合得分F，见表6。12 批样品中浙江省淳安县和湖南省汉寿县的鳖血综合评分最高，证明在无机元素方面这两个产地总体评价更好。

表6 不同产地鳖血主成分得分及综合得分Tab.6 Main component score and comprehensive score of Sanguis Trionycis from different producing areas

3 讨论

本研究采用ICP-MS 法测定全国4 个中华鳖养殖基地中鳖血的无机元素含量，并采用聚类分析和主成分分析探讨无机元素分布规律。基于12 批鳖血样品的18 种无机元素含量测定结果建立的特征图谱显示，不同产地鳖血的无机元素组成具有一致性，但含量存在一定差异。此外，聚类分析结果显示，浙江收集的鳖血能聚为一类，可与湖南、江苏两地区分，提示不同的气候和养殖环境造成了土壤和水质中元素的差异性，间接影响了中华鳖血液中元素的含量，即鳖血质量可能与不同产地相关。主成分分析结果表明Co、V、Fe、K、Sr、Mn、Sn、Na 为鳖血的特征元素。Co、V、Fe、Mn、Sn、Sr 均为人体必须微量元素，其中，Fe 作为鳖血中含量最高的微量元素，能参与氧气运输和物质代谢过程，改善人体造血功能，同时也与人体免疫系统关系密切[14]。Mn 是超氧化物歧化酶的主要成分之一，参与消除自由基、减缓衰老、提高机体免疫功能[15]。Co 作为维生素B12的组成部分，可以帮助血液中红细胞和白细胞形成。V 在维持机体生长发育，促进造血功能，增加免疫力等方面有重要作用。常量元素K、Na 是机体中重要的电解质，可控制体液渗透压和保持酸碱平衡[16]。以上元素所表现出的生理活性与文献[2-3]报道的鳖血免疫调节作用相一致，因此可认为鳖血的这些特征无机元素是其作为炮制辅料的科学内涵。

4 结论

本研究建立了ICP-MS 法测定鳖血中18 种无机元素含量的方法，方法学考察表明其精密度、稳定性、重复性、准确度良好。聚类分析结果表明不同产地的鳖血无机元素特征图谱组成基本一致，含量存在一定差异，且不同区域来源的鳖血能明显区分。主成分分析结果表明，Co、V、Fe、K、Sr、Mn、Sn、Na 是鳖血的特征元素；浙江省淳安县和湖南省汉寿县的鳖血在无机元素方面综合评价较优。本实验建立的鳖血无机元素检测方法快速、准确，为鳖血的质量评价、安全性评价及综合开发利用提供重要参考。