分化型甲状腺癌颈部淋巴结转移相关分子的研究进展

赵小慧，魏明辉，李正江，安常明

（1.国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院 头颈外科，北京100021；2. 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院深圳医院 头颈外科，广东 深圳 518116）

甲状腺癌是内分泌系统，也是头颈部最常见的恶性肿瘤，据统计[1-2]2020 年全球新发甲状腺癌58.6 万例，占全球癌症诊断的3%，在女性恶性肿瘤中位列第四位，是近10 年发病率增长最快的肿瘤。据美国SEER 数据库[3]统计，甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）占所有甲状腺癌的 89.1%； 甲状腺滤泡癌 （follicular thyroid carcinoma， FTC） 和嗜酸细胞癌 （oncocytic carcinoma， OCA） 占 7.9%； 甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC） 占1.8%；甲状腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma，ATC）占1.0%；甲状腺岛状癌占0.2%，其中PTC 和FTC 统称为分化型甲状腺癌 （differentiated thyroid carcinoma，DTC）。虽然DTC 预后良好，5 年生存率由2003 年的67.5%提升至2015 年的84.3%，部分发达欧美国家可达98%[4-5]，但极易早期就出现颈部淋巴结转移（lymph node metastasis，LNM），15%～50%患者初诊时即出现颈部LNM[6]，20%～69%可出现侧颈部LNM[7]，LNM 与较短的无病生存期存在显著关联，这可能会增加颈部复发风险从而影响预后[8-9]。由此可见术前精准评估LNM 在DTC 临床诊治工作中的重要性。

分子标志物检测是近年进展迅速的一种诊断方式，有望成为影像学和病理学鉴别DTC 侵袭性疾病特征如LNM 的有力辅助手段。本文旨在总结并探讨各分子标志物检测在DTC 术前预测颈部LNM 中的应用价值，以期指导DTC 患者颈部淋巴结清扫范围选择，避免过度手术或手术不足导致的医疗资源浪费或不必要的手术创伤。

1 DTC颈部LNM特点

DTC 通常沿颈部淋巴引流途径呈逐站转移，最常发生于靠近甲状腺腺体的中央区淋巴结（Ⅵ区），而后经气管旁淋巴结引流，向上转移至颈静脉链淋巴结（Ⅱ～Ⅳ区）及颈后三角区淋巴结（Ⅴ区），向下转移至上纵隔淋巴结（Ⅶ区），以多区转移为主（占81.4%），仅单区转移较少见[10]，部分可出现跳跃性转移，即无中央区（Ⅵ区）转移，出现侧区（Ⅱ～Ⅴ区）转移，发生率约为1.6%～21.8%，年龄＞45 岁、肿瘤大小＜5 mm、肿瘤位于甲状腺锥体叶或腺叶上极都是出现跳跃转移的危险因素[11]。对于侧区淋巴结而言，一项囊括了18 篇研究的Meta 分析[12]指出转移率由高至低分别为：Ⅲ区（70.5%） ＞Ⅳ区（66.3%） ＞Ⅱ区（53.4%） ＞Ⅴ区（25.3%）＞Ⅰ区（3%）。Li 等[13]分析发现中央区LNM数量≥3 枚以及Ⅱ区LNM 是V 区LNM 的独立危险因素，其中V 区LNM 以Vb 区更多见，Song 等[14]对46 例行治疗性侧颈清扫的PTC 患者研究发现并无患者出现Va 区的LNM。

2 DTC相关信号转导通路

甲状腺癌发病的分子机制主要与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇 -3- 激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B， PI3K/Akt）信号通路的失调有关，但其确切的进展机制仍未阐明（图1）。PTC 常常携带激活MAPK，又称细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路的遗传学变异，其中RET重排和NTRK1 重排、BRAF 突变、RAS 突变在MAPK 激活级联反应中连续发生，但PTC 通常只包含上述单一驱动基因改变，仅约9%的PTC 同时存在端粒酶逆转录酶基因 （telomerase reverse transcriptase，TERT）启动子区突变和BRAF 或RAS突变，这种PTC 的侵袭性高于仅携带一种驱动基因改变的PTC[15]。FTC 多由PI3K/Akt 信号通路转导的基因突变所致，包括PAX8/PPAR-γ-1 重排以及HRAS、NRAS 和KRAS 原癌基因突变等，该通路的主要参与分子包括磷酸酶和张力蛋白同源物缺失（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）、PI3K、Akt 和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），PTEN是对抗Akt 激活来抑制PI3K 信号的关键负调节因子[16]，mTOR 是PI3K 相关激酶蛋白家族的成员，参与识别营养信号和调节细胞生长和增殖[17]。生长因子和细胞因子等通过相应受体，激活PI3K，或通过激活RAS 激活PI3K，进而活化Akt 和mTOR。mTOR 控制细胞内核糖体合成和mRNA 的翻译，参与膜蛋白转运和蛋白质降解，进而调控细胞生长、增殖和代谢。

图1 DTC相关信号转导通路图Figure1 Signal pathways associated with DTC

3 分子标志物在DTC 颈部LNM 预测中的作用

3.1 BRAFV600E突变

BRAFV600E是近年来PTC 诊断中常检的基因靶点，BRAF 基因T1799A 突变导致BRAF 蛋白中V600E 氨基酸由缬氨酸变为谷氨酸，激活BRAF/MEK/MAPK 信号通路，促进肿瘤发生、细胞增殖和转移，在PTC 中的发生率为29%～69%，与PTC 发病机制相关，与良性肿瘤或FTC 的发病机制无关[18-19]。在一些研究[20-21]指出BRAFV600E突变可以强烈预测LNM，且与PTC 包膜外侵犯、较晚的TNM分期、持续性疾病、疾病复发密切相关，但仍有许多研究[22-23]表明BRAFV600E突变阳性与PTC 侵袭性临床病理特征，尤其是LNM 之间并无关联，作为独立分子标志物预测LNM 乃至预后的价值需进一步研究。文献数据报道的不一致性可能与研究患者群体的异质性有关，如不同研究中患者年龄、肿瘤大小、地理位置、肿瘤分期、是否与TERT 基因突变共存等存在显著差异。Silver 等[24]将121 例PTC 患者按肿瘤直径分为两组：直径≤1 cm 组和直径1.1～1.5 cm 组， 即甲状腺微小乳头状癌（papillary thyroid microcarcinoma， PTMC） 组和小PTC 组，研究发现小PTC 组中BRAFV600E突变与LNM呈显著相关（P=0.001 6），而PTMC 组中BRAFV600E突变与LNM 无关。Zha 等[25]也得出相似结论，肿瘤直径＞1 cm、BRAFV600E突变阳性组LNM 发生率是肿瘤直径≤1 cm、BRAFV600E突变阴性组的2.55 倍（P=0.036），调整年龄和性别后仍差异显著。这些研究显示尚未有充分证据将BRAFV600E突变纳入PTMC 患者危险分层，指导积极检测（acute surveillance，AS）或手术方案的选择。Wang 等[26]发现亚洲、欧洲和美洲PTC 患者中，BRAFV600E突变阳性LNM 发生率分别是BRAFV600E突变阴性的1.24、 1.27、2.07 倍。Zhang 等[27]发现与白种人和亚洲人亚组相比，非洲亚组的这种关联更为显著（OR=5.96）。因此当PTC 患者检测到BRAFV600E突变阳性时，还应考虑地理位置及种族影响，评估其LNM 状态。

3.2 RAS突变

约30%的FTC 中存在RAS 突变，其中NRAS 突变较HRAS、KRAS 突变更常见，RAS 突变属于弱驱动突变，在良性甲状腺肿瘤，如14%～48%的滤泡型腺瘤（follicular adenoma，FA） 中也很常见。迄今为止，很少有文献讨论RAS 突变与LNM 的关联，这可能与FTC 较少发生LNM，而多通过血行转移有关。Medici 等[28]指出RAS 突变阳性的结节无论是FA，还是FTC，均无包括LNM 在内的侵袭性临床病理特征，其中5 个样本具有长期前瞻性超声随访（平均8.3 年），也均未显示LNM 迹象，这提示虽然RAS 突变阳性会增加结节恶性风险，但也均为低风险癌症表型。Fukahori 等[29]报道的58 例FTC 中RAS 突变也均与LNM 无关（P=0.41）。

3.3 TERT启动子基因突变

TERT 启动子区域存在C228T 和C250T 两个突变热点，TERT C228T 和C250T 突变在PTC、FTC 中的发生率分别为10%vs. 2%、30%vs. 5%[30]。Bae等[31]发现222 例DTC 患者中TERT 启动子突变阳性与LNM （P=0.011）、侧区LNM （P＜0.001） 有显著相关性，TERT 启动子突变主要出现在更具侵袭性的病例中，如存在远处转移、高细胞变体PTC、广泛浸润型FTC 等，且TERT 启动子突变在BRAFV600E突变阳性的PTC 中更为常见，但也有研究发现TERT 启动子突变与LNM 之间没有显著关联，这可能与研究中大多数患者没有或仅进行了有限的颈部淋巴结清扫术、研究人群异质性、患者数过少等有关。

TERT 启动子突变与BRAFV600E或RAS 突变共存已被证实会增加DTC 侵袭性及不良预后风险，但与LNM 的关系尚未产生定论。Xing 等[32]在507 例PTC 患者中同时检测BRAFV600E和TERT C228T 突变，观察到两种突变均阴性、仅存在BRAFV600E突变和TERT C228T 突变，两种突变共存组LNM 发生率分别为20.2%、42.4%、38.5%、63.6%，差异均具有统计学意义（P＜0.05），发现PTC 患者LNM 与BRAFV600E和TERT C228T 突变均有显著关联，当两种突变共存时，LNM 发生率更高且可显著提示复发与远处转移，在PTC 总体和CPTC 亚组分析研究中，这些结果均成立，且TERT C228T 与BRAF 突变也有显著相关性，二者对PTC 患者LNM 与远期预后的影响具有增量和协同作用。这可能与BRAFV600E激活的MAPK 通路通过生成和增强ETS 因子与TERT 启动因子的相互作用，促进TERT 基因的上调有关[33-34]。但Ren 等[35]通过对342 例PTC 患者进行分子检测发现TERT 启动子突变与BRAFV600E共存与中央区LNM、侧区LNM、LNM 转移枚数＞5、累及或切除淋巴结数均无关。至于TERT 启动子突变和RAS 突变共存病例也没有表现出LNM 迹象[29]。

3.4 RET和NTRK重排

PTC 与3 种不同的跨膜酪氨酸激酶基因重排有关：RET、NTRK1 和NTRK3，RET 重排所得的嵌合基因被称为RET/PTC，NTRK 重排所得的嵌合基因被称为TRK，其产生的嵌合蛋白具备非配体依赖性激活的酪氨酸激酶活性。早期的一些研究认为无法发现RET 重排与PTC 的任何临床病理特征包括LNM 存在密切关联，相较之下RET/PTC3 通常使PTC 具备更有侵袭性的表型，但也与LNM 无关，后来Zhou 等[36]在50 例PTC 患者中研究发现，8 例存在RET 重排，且RET/PTC 与LNM 显著相关，RET/PTC 阳性患者局部扩散率和淋巴结受累率均高于RET/PTC 阴性病例，在5 例RET/PTC 和BRAFV600E突变共存患者中，相关性进一步增强，且RET/PTC 阳性组NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β 的表达增加，提示RET/PTC 可能增强NF-κB 的活性、炎症介质的表达和淋巴结的转移。NTRK1/3 重排在成人PTC 中罕见，发生率为2.3%～6.7%，有限证据表明其可能与频繁的LNM 相关，Chu 等[37]在11 例NTRK重排甲状腺癌患者中研究发现，初诊时所有患者原发病灶均具有多结节生长模式，以广泛的淋巴管浸润和颈部LNM 为特征。但由于RET 重排、NTRK 重排发生阳性率太低、样本量太小，这些结论仍需要更多的证据支持。

3.5 基质金属蛋白酶家族（matrix metalloproteinase，MMP）

MMP 中MMP-9 是肿瘤发生过程中基底膜降解、包膜外侵犯、侵袭性增强的关键性酶之一，Liu等[38]纳入112 例PTC 患者，研究发现MMP-9 表达显著上调，且存在中央区LNM、侧区LNM 或晚期肿瘤LNM （Ⅲ+Ⅳ） 的MMP-9 表达水平更高。Zhang等[39]发现PTC 伴与不伴LNM 患者MMP-9 表达强度差异有统计学意义，MMP-9 的强表达（+++）主要见于伴有LNM 的PTC（80.95%，17/21）。Li 等[40]发现MMP-9 的mRNA 和蛋白表达水平与LNM 显著相关，同时TGF-β1、SNAI1 和MMP-9 蛋白表达之间存在显著相关性，任何两个或全部三个分子的同时表达与LNM 的相关性比单独表达强。Bumber等[41]发现PTC 患者MMP-1 和TIMP-1 表达水平与LNM 相关，在侧区LNM 组的表达水平最高，可被视为侧区LNM 的预测因素，而MMP-2、MMP-9 的表达水平与侧区LNM 无关。

3.6 Ki-67

Ki-67 增殖指数是细胞增殖的标志物，被认为是甲状腺癌预后分类的可靠标志物。Zhou 等[42]报道了108 例PTMC 中Ki-67 与中央区LNM 有显著关联（P＜0.01），可作为判断临床进展和判断预后的重要指标。Lei 等[43]研究发现PTC 患者中Ki-67 指数＞3%与中央区淋巴结转移（CLNM）显著相关，当Ki-67指数＞5%时，更能提示CLNM 和更高的淋巴结受累率。Matsuse 等[44]和Aydogan 等[45]却得出了直接相反的结果，即Ki-67 与LNM、临床侧区LNM（N1b）、病理证实的LNM（pN1）均无显著相关，只与远处转移有关。文献数据的不一致性可能与各研究中患者群体的Ki-67 增值指数范围存在明显差异。Matsuse 等[44]称Ki-67 结合TERT 启动子或BRAFV600E突变虽与LNM 关联缺乏统计学差异，却在预测PTC 复发方面表现出色，复发危险比为6.225～8.8，因此需要更多研究发现Ki-67 与其他分子突变组合对LNM 的预测价值。

3.7 其他分子标志物

血管内皮生长因子C（VEGF-C）引导肿瘤相关淋巴管生长并促进循淋巴系统传播，Šelemetjev研究[46-47]发现PTC 患者中， VEGF-C 协同活性MMP-9 或survivin 蛋白的高水平表达与LNM 显著相关（P＜0.005），抑癌基因PTEN 丢失可诱导成纤维细胞迁移和增殖从而促进FTC 进展[48]，韩国一项研究[49]表明无论组织学亚型如何，PTEN 丢失都与LNM 相关（P=0.007）。半乳糖凝集素3（galectin 3，GAL3）在细胞黏附、肿瘤发生发展过程中起重要作用，研究发现GAL3 在PTC 原发病灶中高表达与LNM 显著相关，在LNM 病灶中却低表达，提示LNM 病灶中GAL3 下调可能是促进肿瘤细胞从原发病灶中释放出来发生LNM 的原因。Yu 等[50]在60 例PTC 患者中抽取血标本检测GAL3 和环状RNA（circular RNAs， circRNA） 中的circRNA-UMAD1，研究发现二者可作为协同外周血分子标志物预测PTC 患者是否存在LNM，在有LNM 的PTC 患者外周血中，GAL3 和circRNA-UMAD1 表达均显著升高，受试者工作特征曲线 （receiver operating characteristic， ROC） 下面积（the area under the curve ，AUC）为0.87，较单一标志物预测LNM 的敏感度、特异度均有所增加。血浆和尿液外泌体蛋白含量丰富，Chen 等[51]研究发现血浆中两种微小RNA（microRNA，miRNA），miR-6774-3p 和miR-6879-5p 对PTC 患者LNM 具有良好的诊断效率，其组合可使诊断预测效能进一步提高。Huang 等[52]发现尿液中甲状腺球蛋白（U-Ex-Tg）浓度升高与Ⅳ区LNM 相关。

DTC 总体上来讲是高度可治愈的，但仍有相当一部分患者出现区域LNM，出现侵袭性肿瘤行为和高疾病复发率、病死率。目前，术前评估是否有区域LNM 主要通过影像学手段，或对明显肿大的淋巴结进行粗针穿刺病理活检，分子检测无疑提供了一种无创、有可能会更加准确敏感的新思路，虽然临床研究数据目前仍存在矛盾和争议点，但联合应用几种分子标志物预测LNM 情况、亚组分析等研究正在开展，以期为临床上DTC 淋巴结清扫问题提供解决新思路。

利益冲突：所有作者均不存在利益冲突。

作者贡献声明：赵小慧负责论文撰写、文献整理、文献阅读；安常明、李正江负责研究指导、研究设计与经费支持；魏明辉负责文献整理、经费支持。