T-cadherin通过下调EGFR-PI3K-AKT信号轴抑制膀胱癌的发展

崔万里,衣 琳,宋立友,晋学飞*

(1.吉林大学中日联谊医院 泌尿外科二病区·吉林省泌尿系统肿瘤分子诊断重点实验室·吉林省泌尿系统肿瘤重点实验室,吉林 长春130033;2.吉林市化工医院 老年病科,吉林 吉林132021;3.吉林省肿瘤医院,吉林 长春130012)

膀胱癌(Bladder cancer,BC)是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤,目前治疗的主要方法是经尿道膀胱肿瘤切除术或通过根治性手术和尿路改道联合或不联合辅助治疗进行治疗,但BC的治疗和诊断仍不能令人满意,初次治疗后的复发率高[1-3]。T-钙黏蛋白(T-cadherin,T-cad)是钙黏蛋白超家族的非典型成员,在肿瘤新生血管形成、细胞凋亡、细胞周期和细胞增殖中发挥着关键作用,T-cad的异常表达与多种恶性肿瘤的发生发展、临床病理因素以及癌症患者的预后密切相关[4-6]。表皮生长因子受体(EGFR)通过与其配体的结合激活后诱导细胞分化和增殖[7]。有研究表明,细胞中T-cad的丢失会促进EGFR运输和核转位,从而有助于EGFR的促增殖效应[8],作为EGFR的下游信号,PI3K-AKT信号的激活在多种肿瘤细胞的增殖中发挥重要的调控作用[9]。本研究拟探究T-cad是否可通过EGFR-PI3K-AKT信号轴调控膀胱癌的发生和发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1组织样本 收取2020年9月至2022年5月间在泌尿外科治疗的40例膀胱癌患者膀胱癌组织和血液样本,其中男 25 例,女 15 例;年龄48～75岁,平均年龄为62.29±8.47岁。纳入标准:(1)依据《新编常见恶性肿瘤诊治规范》诊断为膀胱癌的患者;(2)患者知情同意;(3)行膀胱癌切除术且切缘未见癌细胞浸润的患者。排除标准:(1)患有精神疾病,依从性较差患者;(2)合并其他恶性肿瘤患者;(3)合并其他器官严重病变患者。收取对照组人群血液样本,对照组人群为同期就诊的非膀胱癌患者40例,按性别相同、年龄±3岁与膀胱癌患者进行1∶1匹配,同时排除以下疾病患者:(1)慢性代谢性疾病,包括高血压、糖尿病和血脂异常;(2)膀胱疾病,如膀胱炎、膀胱良恶性肿瘤等;(3)其他恶性肿瘤;(4)精神疾病。本研究经吉林大学中日联谊医院伦理委员会审核批准,并获得所有患者知情同意。

1.1.2细胞培养 本研究使用人膀胱癌细胞系EJ1进行相关研究。

1.1.3主要试剂 SYBR Green PCR master Mix试剂盒,RPMI-1640培养基、胰酶、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗,Lipofectamine 2000,T-cad抗体、EGFR抗体、PI3K p110α、p-AKT抗体,GAPDH抗体。

1.2 方法

1.2.1qPCR检测膀胱癌患者和对照组人群血清中T-cad mRNA表达水平 提取血清RNA,逆转录后进行基因扩增,比较两组T-cad mRNA表达水平差异。引物设计如下,Forward:5’-CTCGTTCTGTGCGTTCTCCTGTC-3’,Reverse:5’-CTCAGAGCAACTAAGCCGCCATC-3’;选择GAPDH作为内参,引物序列,Forward:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’,Reverse:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

1.2.2分析T-cad表达水平与膀胱癌患者性别、年龄、临床分期和病理分级的关系 按照血清 T-cad mRNA 的表达水平(2-△△T公式法)将膀胱癌患者分成T-cad高表达和低表达两组,具体计算步骤如下:进行qPCR反应后,同时测量目的基因T-cad和内参基因GAPDH的Ct值。使用公式2^-ΔΔCt来计算T-cad基因的相对表达量。如果结果大于1,表示T-cad基因的表达水平在膀胱癌组高于参考值,即为高表达;如果结果小于1,表示T-cad基因的表达水平在膀胱癌组低于参考值,即为低表达。分析血清T-cad mRNA的表达水平与膀胱癌患者性别、临床分期、病理分级的关联性。

1.2.3建立T-cad过表达EJ1细胞系 实验分3组,空白对照组(Control)、空载组(Vector,不含T-cad序列的空载对照组)、T-cad过表达组(T-cad-OE)。T-cad过表达,首先将T-cad CDS序列克隆到 pLVX IRES载体,使用Lipofectamine 2 000将载体和病毒包装质粒转染EJ1细胞;48 h后收集病毒上清液,通过0.45 μM过滤器过滤,0.8 μg·mL-1Polybrene与细胞共孵育48 h;然后向培养基中加入200 μg·mL-1嘌呤霉素用于培养细胞1 w后,进行相关实验。

1.2.4CCK8法检测细胞增殖能力 取1 000个对数生长期细胞接种于96孔板中24 h后进行增殖实验;将CCK8试剂盒中试剂原液稀释至实验使用浓度;从细胞培养箱中取出细胞培养板,弃掉孔板中培养基;每孔加入100 μL稀释后的CCK8工作液,放入培养箱中孵育1 h后,将上清转移至新的96孔板中,使用酶标仪在450 nm波长处测定OD值。

1.2.5克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 将500个细胞接种于6孔板中,放入培养箱中持续培养2 w,每4 d更换1次培养基。2 w后从培养箱中取出6孔板,吸出培养基并弃掉,使用PBS缓冲液清洗。加入4%多聚甲醛室温固定15 min后弃掉固定液,然后加入1 ml结晶紫溶液室温染色10 min,弃掉结晶紫溶液,加入清水清洗并室温条件下晾干,待完全晾干后,计数克隆形成数。

1.2.6Western blot 法检测相关信号分子表达 收集细胞,加入200 μl RIPA裂解液 4℃裂解 30 min;4℃,12 000 g离心15 min后收集上清并使用BCA法检测蛋白浓度。加200 μl Loading Buffer并放入金属域中100℃加热5 min;将丙烯酰胺凝胶放入电泳槽中并加入适量电泳液,加入20 μg蛋白样;80 V稳压进行电泳,当溴酚蓝指示剂到达凝胶底部时,关闭电源进行转印实验,100 V稳压进行转印80 min。将PVDF膜完全浸泡在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育封闭1 h。然后将PVDF膜放入一抗(T-cad、EGFR、PI3K p110α、p-AKT、GAPDH)中过夜孵育;次日,取出PVDF膜,TBST缓冲液清洗后,将PVDF膜放入稀释好的二抗中室温孵育1 h;TBST缓冲液清洗后,将PVDF膜完全浸泡在配制好的ECL发光液中,使用化学发光凝胶成像系统采集图像。

实践民俗学需要关注个人叙事，这不仅是深入了解当地人的要求，而且是创新民俗志书写和研究范式的要求。我们有必要从实证的民俗志书写理念转到对话与交流的民俗志书写理念上来。

2 结果

2.1 T-cad在膀胱癌患者和对照组人群中转录水平差异

结果表明,膀胱癌患者血液中T-cad mRNA表达水平低于对照组,对照组血清中T-cad mRNA水平是膀胱癌组的2.8倍,差异具有统计学意义(P<0.001),如图1所示。

图1 膀胱癌组与对照组人群血清中T-Cad mRNA表达水平

2.2 T-cad mRNA的表达水平与膀胱癌患者一般特征及临床特征的关联性

结果表明,2组患者在年龄、性别、肿瘤分期方面差异无统计学意义(P>0.05)。病理分级为G1的8例患者,其中2例低表达,6例高表达;病理分级为G2～G3的32例有21例低表达,11例高表达。T-cad低表达和高表达两组患者在肿瘤病理分级方面具有统计学差异(P<0.05),见表1。

表1 T-cad mRNA表达水平与膀胱癌患者一般特征和临床特征的关系

2.3 T-cad过表达EJ1细胞系中T-cad的表达

图2 T-cad转染后表达

2.4 T-cad过表达后EJ1细胞增殖能力变化

结果如图3(A)所示:与对照组和Vector组相比,T-cad过表达组EJ1细胞活力减弱,差异具有统计学意义(P<0.001),表明T-cad过表达可抑制EJ1细胞增殖能力。结果如图3(B)显示,与对照组和Vector组相比,T-cad过表达组EJ1细胞系克隆形成数量减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。表明T-cad过表达可抑制EJ1细胞的克隆形成能力。

图3 过表达T-cad对EJ1细胞增殖和克隆形成能力的影响

2.5 T-cad过表达对EGFR-PI3K-AKT信号轴的影响

Western blot结果显示:与空白对照组和Vector组相比,过表达T-cad组EJ1细胞EGFR表达水平下调,表达量约为对照组的60%,差异具有统计学意义(P<0.01);同时,PI3Kα和p-AKT相对表达水平也下调,差异具有统计学意义(P<0.001)。见图4。

图4 过表达T-cad后相关信号分子表达

3 讨论

膀胱癌具有易复发、预后差、5年生存率低以及易发生转移等特点[10-12]。钙黏蛋白家族是一类细胞间黏附分子,主要分布于各种上皮组织,介导异型细胞间的黏附。T-cad基因位于染色体16q24,由于它在许多不同的癌症中经常被沉默,因此长期以来一直被认为是一种肿瘤抑制因子[13]。本研究通过对比膀胱癌患者与对照组人群血清中T-cad mRNA表达水平发现,膀胱癌患者血清中T-cad表达水平低于对照组,说明膀胱癌的发生与T-cad的表达降低有关。为探讨T-cad的表达水平是否与膀胱癌的进展和恶性程度有关,本研究进一步分析了T-cad mRNA与膀胱癌分期、病理分级之间的关系。在本研究中发现,T-cad的表达水平影响膀胱癌的病理分级,T-cad表达水平较低的膀胱癌病理分级较高,肿瘤恶性程度较高,但其中的具体机制尚不清楚。

有研究证实,T-cad是皮肤鳞状细胞癌中EGFR通路活性的辅助负调节剂。T-cad通过影响EGFR的膜区室化来调节EGFR通路活性;T-cad上调促进EGFR在脂筏中的保留,而T-cad沉默从该隔室释放EGFR,使EGFR更容易受到配体刺激[14-15]。EGFR是受体酪氨酸激酶(Rtk)家族成员之一,可以激活PI3K-AKT信号通路,促进细胞增殖。研究表明,在低分期膀胱癌(Ta)中,约20%患者表现出EGFR的上调,而在高分期膀胱癌(≥T2)中,约有高达50%的患者都表现出EGFR表达的上调[16],可见EGFR在诱导膀胱癌进展中的重要性。本研究中制备了T-cad过表达膀胱癌细胞株(EJ1),通过CCK-8实验、克隆形成实验探究T-cad过表达对EJ1细胞生物学行为的影响,实验结果表明T-cad过表达抑制EJ1细胞的增殖能力、克隆形成能力。进一步探究EGFR-PI3K-AKT信号轴相关信号分子的表达变化,结果表明T-cad过表达抑制EJ1细胞EGFR、PI3Kα、p-AKT的表达。

综上,T-cad通过抑制EGFR的活性从而抑制PI3K-AKT信号通路,抑制膀胱癌的发生;而T-cad的表达降低,使其丧失对EGFR的抑制作用,导致膀胱癌的发生和发展。