针灸对呼吸机相关性肺炎大鼠炎症因子的影响*

杨小芳,邓扬嘉

(1.贵州中医药大学,贵州 贵阳 550002;2.重庆市中医院,重庆 400021)

呼吸机相关性肺炎( ventilator-associated pneumonia,VAP) 是 ICU中最为普遍的一种医院感染[1]。根据资料显示[2-3],重症监护室中出现 VAP的风险在9%到27%之间,死亡率高达70%以上。当病人出现VAP时,极易导致病人脱机困难,从而提高其死亡率。研究表明[4-6],发生VAP时,多种炎性细胞及炎性因子(如中性粒细胞、巨噬细胞及TNF-a、MPO等)均参与了其发病过程,因此减少炎症因子的释放对缩短VAP患者的缩短住院时间,改善患者的症状具有一定的作用。西医主要侧重于使用抗感染药物进行治疗,然而,广泛应用广谱抗生素导致细菌耐药问题日益严峻,从而影响了对VAP的治疗效果[7]。近年来,中医药对VAP治疗的研究进展迅速,针灸被认为是一种安全有效的辅助治疗方法[8-9],电针疗法能够减少肺组织和血浆中炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的分泌,从而减轻肺纤维化。研究[10-11]表明,针灸可显著改善患者的鼻症状和肺功能,证实了针灸的抗炎作用。美国临床实践指南等临床指南推荐针灸治疗变应性鼻炎和急性咽炎[12-13]。然而,在预防和治疗呼吸机相关性肺炎方面,针灸并没有得到广泛运用。因此,本研究通过建立呼吸机相关性肺炎大鼠模型,并检测大鼠血清ET、TNF-α、IL-1β、MPO水平,来评估针灸对呼吸机相关性肺炎大鼠肺组织中发生的炎症反应程度的影响,以期为VAP治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料 雄性SD大鼠36只,体重 200～300 g,成都药康生物科技有限公司提供,许可证号:SCXK(川)2020-034。实验细菌:铜绿假单胞菌,菌种编号:CCTCCAB202053,来源:中国典型培养物保藏中心。实验仪器 超低温冰箱 (Sanyo-382AT,日本)、电子分析天平(Precisa12A,瑞士)、小动物呼吸机(成都市新津事丰医疗器械有限公司)、高压灭菌锅(上海赛洋,中国)、显微外科手术器械包(SSW-3型,上海手术器械厂)、纯水仪(Millipore,德国)、酶联免疫检测仪(美国ThermoFisher仪器有限公司)、BX43光学显微镜(日本Olympus 公司)。实验试剂 酶联免疫吸附法内毒素( ET,试剂批号JL 13330-96T)、肿瘤坏死因子 ( TNF-α,试剂批号E-EL-H0109e)、白介素1β(IL-1β,试剂批号E-EL-R0012e)、髓过氧化物酶(MPO,试剂批号E0BC-KD74-M)试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。生理盐水(黑龙江齐泰动物保健品有限公司)。细艾条(直径7 mm,时时康艾灸堂;0.30 mm× 25 mm一次性无菌针灸针(无锡佳健医疗器械股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及构建VAP大鼠模型 建立大鼠呼吸机相关性肺炎模型[14]:取健康雄性大鼠36只用随机数字表法机分为对照组、模型组、针灸组,适应性喂养一周后进行实验。除对照组外,其余各组在进行气管插管前禁食12h,然后腹腔注射4%戊巴比妥钠进行麻醉,固定在动物手术台上,取仰卧位,将自制备的气管导管在喉镜的帮助下插入声门,首先,要根据听诊大鼠的双肺呼吸音来判断导管是否已经插入到了气管中。之后,将气管导管的外侧与大鼠的上唇进行缝合并固定,再与小动物的呼吸机相连,从而进行呼吸。呼吸机设置为:潮气量(V)12 mL/kg,呼吸频率70次/min,吸入的氧气浓度(FiO2)100%。为了预防姿势所致的肺不张,应在30 min内进行2～3次大 VT换气。3～5 mL/h的5%葡萄糖盐水经股静脉插入导管注入。机械通气持续24 h后,进行肺部感染:使用微量注射器经气管导管快速注入0.2mL铜绿假单胞菌(PA)菌液和0.5 mL的无菌气体,并保持体位并持续5 min,对照组同法给予等量生理盐水。注射完毕后竖起大鼠保持体位5 min使菌液均匀进入肺组织。实验结束后,进行了逐层的肌肉和皮肤缝合。

1.2.2 治疗方法 对照组:单纯的喂养不予其他处理。模型组:每日灌胃生理盐水2 mL×7 d。针灸组:于注射菌液造模后30 min后进行针灸治疗[15],选取大鼠常用穴位定位:“肺俞”:第3胸椎下两旁肋间;“大椎”:第7颈椎与第1胸椎间,背部正中;“风门”:第2胸椎下两旁肋间。选用一次性毫针,“大椎”斜刺5 mm,“肺俞”、“风门”各斜刺6 mm,留针30 min,运用平补平泻手法每10 min行针1次,每日2次,共7 d。于针刺治疗结束后将点燃的艾条[16],距相同穴位皮肤表面2 cm处实施温和灸,施灸15 min,每日2次,共7 d。

1.2.3 观测指标及检测方法

1.2.3.1 一般情况 需要观察大鼠的一般行为学变化,包括精神状况、反应能力、活动度、摄食量、摄水量和大小便等,并注意是否出现烦躁不安、呼吸急促或口唇发绀等表现。

1.2.3.2 ELISA法检测大鼠外周血中TNF-α,IL-1β,ET、MPO含量 大鼠麻醉后腹主动脉取血于无抗凝真空管中,将大鼠血液于4℃、3 000 r/min、半径13.5 cm、离心15 min,取上清-80℃ 冷藏备用。取得样本后,参照酶联免疫吸附法试剂盒指导说明进行操作。

1.2.3.3 肺组织病理学观察 ELISA检测结束后,打开胸腔,剪取部分右肺中段组织,迅速将其浸入4%多聚甲醛固定24 h,经乙醇脱水后,置于60℃蜡盒内浸蜡、包埋,切片(厚4μm),分别于苏木素和伊红染液中染色、脱水、中性树胶固定、封片,以观察肺组织病理学改变。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0软件分析数据,对所有的样本进行了正态性、方差齐性的检验,符合正态性检验,组间比较进行单因素方差分析,当方差齐的时候,可以使用LSD方法,当方差不齐的时候,使用DunnettT3方法,当不符合正态性的时候,使用秩和检验,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况比较 在整个实验过程中,对照组大鼠的精神状态良好,反应灵敏,毛发光亮有神,呼吸节律平稳有序,二便正常,没有出现异常分泌物;模型组的大鼠在注入铜绿假单胞菌菌液后,则逐渐出现呼吸急促、不安、口唇发青以及行动迟缓等反应,随着天数的增加这些大鼠逐渐出现精神萎靡或焦躁不安等异常表现,并且毛色变得枯槁而无光泽;针灸组大鼠在注入铜绿假单胞菌菌液后,亦有上述反应,但整体症状与模型组比较明显减轻。

2.2 大鼠血浆TNF-α、IL-1β、ET、MPO水平变化 单因素方法分析结果显示,各组大鼠血浆ET,TNF-α、IL-1β、MPO水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较结果显示,与空白对照组比较,模型组大鼠血浆的TNF-α、IL-1β、ET、MPO水平均高于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,针灸组大鼠血浆的TNF-α、IL-1β、ET、MPO水平均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠炎症因子的比较

2.3 肺组织病理形态学比较 对照组大鼠肺部形态正常,肺泡壁面完好,仅有极少的炎性细胞在支气管内的浸润;与空白对照组比较,模型组大鼠肺组织结构重度异常,肺泡壁增厚,肺重度实质化,并可见支气管周围大量炎症细胞浸润;与模型组比较,针灸组大鼠肺泡壁增厚情况改善明显,支气管周围和肺泡组织内部分炎症细胞明显减少。

对照组

3 讨论

VAP在重患者室患者进行侵袭性机械通气后,大部分容易导致肺部感染,伴有严重的基础疾病和免疫低下患者,与细菌大分化及病毒感染引起的肺损伤及细胞因子不均衡有关。机械通气等异物回到呼吸器官后,暴露在细菌和内毒素等外部热源的情况增加,因此分泌细胞因子,肺部受损,引发肺部炎症。炎症反应会增加细胞因子的分泌,从而加剧炎症反应[17-18]。当 VAP患者受到细菌和真菌感染时,会释放内毒素,激活单核细胞-巨噬细胞系统,导致TNF-α和IL-1β 的产生,产生炎症介质引起炎症反应,破坏组织。内毒素对人有害,当细菌死亡并通过人工方法溶解或消灭时,内毒素的释放会引起发热和白细胞反应[19]。TNF-α是一种多效应的细胞因子,主要由激活的单核-巨噬细胞分泌,参与炎性反应和免疫应答[20-21]。TNF-α同样也是引发炎性介质连锁反应的第一个因素,它可以将人体内的IL-1β等炎性介质进行活化。IL-1β主要由活化的单核细胞或巨噬细胞产生,经常出现在血液中,在发热和炎症反应中扮演重要角色。TNF-α和IL-1β炎症或细胞因子在细胞中的产生可由体内的相互作用引发,从而对肺组织造成损害[22-23]。MPO是一种过氧化物酶,存在于中性粒细胞的嗜天青颗粒中。它在炎症反应中发挥着重要作用,并具有强大的抗菌和抗病毒功能。因此,监测TNF-α、IL-1β、MPO、ET水平可以帮助评估VAP大鼠的炎症反应程度、严重程度以及预后情况等方面提供指导意义。

在中医学理论中并没有对VAP的描述,但根据其致病特点及气急、喘息、脓痰等临床表现,多归属于“喘证”、“肺胀”、“痰饮”、“伤寒”等范畴[24]。本病病位在肺,与脾、肾密切相关,基本病机为 "气虚邪盛"。肺主气,肺气虚弱是本病发病的主要原因。接受机械通气的患者,病情严重,体质下降,五脏功能不全,肺的通气能力下降。外邪入肺,郁遏肺气,宣发无力,痰浊阻肺,呼吸困难,是本病的病因。针刺是利用特定的针刺手法,将针刺入人体特定部位以达到疗效,具有舒经活络、理筋止痛等功能。艾灸是一种中医特色治疗方法,可以温补肺气、活血化瘀。据研究表明,艾灸还能够调节肠道菌群,减少炎症反应等作用[25]。肺俞是背部的一个穴位,对于清热解表、止咳平喘有很好的效果。大椎则是三阳督脉之会,具有益卫固表、振奋全身阳气和止咳平喘的功效。风门也能够起到清热、止咳平喘的作用。Li J等[26]发现,在针刺大鼠的肺俞、肾俞和定喘穴进行治疗时,可以降低IL-8和TNF-α水平。本实验结果显示,模型组大鼠血浆的TNF-α、IL-1β、ET、MPO水平明显高于空白对照组,提示VAP模型大鼠肺组织呈高炎症反应,证实上述炎症因子与VAP炎性反应有着密切的内在联系。与模型组比较,针灸组大鼠血浆的TNF-α、IL-1β、ET、MPO水平均下降,肺脏中炎性细胞、中性粒细胞数量通过针灸治疗后而减少,原因可能与针灸减轻VAP大鼠组织损伤、抗炎等作用有关系,但具体调控机制尚未明确,后续实验仍需进一步研究。