CHI3L1在川崎病样血管炎小鼠模型冠状动脉损伤中的作用及机制研究

曹越 高帅 罗刚 赵水炎 唐雅琪 杜占慧 泮思林

（青岛大学附属妇女儿童医院心脏中心，山东青岛 266034）

川崎病（Kawasaki disease, KD）是一种急性全身性非特异性血管炎，1967 年由日本医生川崎富作首次报道，主要临床特征包括发热、皮疹、颈部淋巴结非化脓性肿大等症状［1］。KD 最严重的并发症是冠状动脉损伤（coronary artery lesion, CAL），如未得到及时有效的治疗，CAL 的发生率可高达15%～25%，即使接受静脉注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin, IVIG）及阿司匹林治疗，CAL 的风险仍高达4%［2］。长期以来，对KD所致CAL 形成的病理生理学过程中分子机制尚未明确了解。持续性的亚急性和慢性血管炎可导致长期的血管改变和重塑，炎症对KD血管内皮细胞造成严重和持续的损害可能是重要原因［3］。因此，深入了解KD的血管内皮细胞炎性损伤机制，是防治KD早期CAL的关键领域之一。

壳多糖酶3 样蛋白1（chitinase 3-like protein 1,CHI3L1）是一种炎症性糖蛋白，在急性、慢性和亚临床炎症条件下由各种细胞分泌［4］。据报道，血清CHI3L1 水平升高参与调节多个关键生物过程，包括炎症激活、氧化损伤及细胞凋亡等［5］。CHI3L1 在多种炎症性疾病中都发挥着重要作用，多项研究证实，CHI3L1 可能通过介导炎性损伤参与冠状动脉粥样硬化的进展情况［6-8］。然而，目前尚未明确CHI3L1 是否在KD 患儿CAL 的发生、发展中起作用。本研究旨在分析干酪乳杆菌细胞壁成分（Lactobacillus caseicell wall extract, LCWE）诱导下的KD 样血管炎小鼠模型中CHI3L1 的表达情况，初步探讨CHI3L1 在KD 所致CAL 中的作用及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

CP100NX 超速离心机购于日本Himac 公司，超声破碎仪购于宁波新芝生物科技股份有限公司，多功能酶标仪购于美国Perkin Elmer 股份有限公司。干酪乳杆菌菌种购于北京北纳创联生物技术研究院，糖类总量定量检测试剂盒购于上海杰美基因医药科技有限公司，十二烷基硫酸钠（SDS）、核糖核酸酶（ribonuclease, RNase）、脱氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonuclease Ⅰ, DNase Ⅰ）、胰蛋白酶、MRS 肉汤培养基购于北京索莱宝科技有限公司，软骨糖蛋白39（CHI3L1）检测试剂盒（酶联免疫吸附试验法）购于武汉云克隆科技股份有限公司，兔抗CHI3L1、鼠抗Bcl-2 抗体购于英国Affinity 公司，鼠抗α-SMA、兔抗α-SMA、鼠抗VE cadherin、兔抗Bax、兔抗Caspase-3 抗体购于美国Abcam 公司，兔抗NF-κB、兔抗p-NF-κB 抗体购于美国Cell Signaling Technology 公司，鼠抗CHI3L1、兔抗vWF、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG 购于武汉三鹰生物技术有限公司，鼠抗β-tubulin 抗体购于上海Abmart 公司，Alexa Fluor 488 标记羊抗鼠IgG、Alexa Fluor 647 标记羊抗兔IgG 购于美国Abcam公司。

1.2 萃取LCWE

根据文献提供的造模方法［9］，将干酪乳杆菌菌种接种于MRS肉汤培养基中，在37°C厌氧环境中培养48 h，经离心和弃去上清的步骤，得到菌体沉淀物。向沉淀物中加入4% SDS 并在室温过夜，随后进行离心和洗涤，去除SDS及细菌碎片，再次得到沉淀物。向其中依次分别加入RNase、DNaseⅠ、胰蛋白酶消化处理，每一步消化后离心弃去上清，最后用PBS重悬沉淀，经超声破碎和超速离心处理后，取上清即为LCWE。使用糖类总量定量检测试剂盒测定LCWE 含量，调整浓度为1 mg/mL，用于后续实验。

1.3 实验动物的分组与处理

SPF 级雄性C57BL/6 小鼠20 只，4 周龄，体重20～25 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司［动物合格证号：SCXK（鲁）20200009］。本研究已经通过青岛大学伦理委员会审核批准（动物实验伦理号：202304C5712202306069）。所有小鼠适应性喂养1周后，将实验动物按随机数目表法分配原则分为正常对照组及模型组，每组10 只。模型组小鼠单次腹腔注射LCWE 0.5 mL，对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水。分别在注射完后的第3天、第7 天和第14 天观察小鼠的一般情况，并在第14天时对小鼠进行称重。

1.4 样品收集

两组小鼠完成腹腔注射14 d后，采用4%水合氯醛溶液（0.1 mL/10 g）腹腔注射对小鼠进行麻醉，腹主动脉取血0.5 mL，2 000 r/min离心20 min，分离血清，置于-80°C保存，用于后续生化指标检测。处死小鼠，在解剖板上固定小鼠四肢，沿前正中线剪开皮肤，依次剖开胸腔、腹腔，分离取出心脏组织与脾脏组织，在大体显微镜下，小心夹取冠状动脉根部，从心脏表面缓慢逆行剥脱冠状动脉组织。一部分冠状动脉组织及脾脏组织采用4%多聚甲醛溶液进行固定，置于室温保存，行组织病理学检测；另一部分冠状动脉组织置于-80°C冰箱冻存，以备后续实验使用。

1.5 苏木精-伊红染色

取小鼠冠状动脉组织及脾脏组织样品后经梯度浓度乙醇脱水，再置于二甲苯溶液中透明，之后置于石蜡中包埋。将其切成厚度为3～5 μm 的切片，进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin， HE）染色，在光学显微镜下观察，采集图像并分析。

1.6 酶联免疫吸附法

取出-80°C中保存的小鼠血清，按说明书要求进行检测，根据标准曲线和吸光度（OD）值计算CHI3L1含量。

1.7 免疫荧光染色

采用免疫荧光双染色法通过标记α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）来检测各组小鼠冠状动脉组织内皮标记物血管性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）和CHI3L1的表达。冠状动脉组织经多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片，石蜡切片脱蜡前需放在60°C恒温箱中烘烤2 h，经过脱蜡、水化、抗原修复后，内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育20 min，10%正常羊血清室温封闭20 min，分别加入一抗鼠抗CHI3L1（1∶100）、兔抗α-SMA（1∶100）和兔抗vWF（1∶100）、鼠抗α-SMA（1∶200）4℃孵育过夜，次日对应加入二抗Alexa Fluor 647 标记羊抗兔IgG （1∶100）、Alexa Fluor 488 标记羊抗鼠IgG（1∶100）室温避光孵育2 h，滴上DAPI染色，用载玻片封片，在正置荧光显微镜下观察并采集图像。

1.8 Western blot检测

取-80°C中保存的冠状动脉组织，研磨后加入组织裂解液，离心后取上清液并使用BCA 法测定蛋白浓度。取待测蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后封闭，分别加入一抗兔抗CHI3L1（1∶1 000）、兔抗vWF （1∶1 000）、鼠抗VE cadherin（1∶1 000）、兔抗Bax（1∶1 000）、鼠抗Bcl-2（1∶1 000）、兔抗Caspase-3（1∶1 000）、兔抗NF-κB（1∶1 000）、兔抗p-NF-κB（1∶1 000）、鼠抗β-tubulin（1∶1 000）4℃孵育过夜，次日对应加入二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000）、山羊抗鼠IgG （1∶2 000） 室温孵育1 h，ECL 显影。用Image J 分析软件分析各条带灰度值，以目的蛋白灰度值与内参蛋白β-tubulin 灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验独立重复至少3次。

1.9 统计学分析

采用SPSS 26.0 软件对数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（xˉ±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠一般情况

腹腔注射LCWE 3 d 后，与对照组相比，模型组小鼠出现毛发干枯，反应迟缓，饮食能力下降；7 d 后有个别小鼠肢端出现充血肿胀，鼠尾坏死。模型组小鼠体重［（21.0±0.8） g］ 较对照组［（24.2±1.5）g］下降（t=6.025，P＜0.001，n=10）。

2.2 冠状动脉及脾脏组织HE染色结果

对照组小鼠冠状动脉组织内膜光滑完整，内皮细胞排列整齐，周围无炎性细胞浸润；而模型组小鼠冠状动脉组织内膜欠光滑，内皮细胞排列紊乱，周围有大量炎性细胞浸润。对照组小鼠脾小体结构完整，未见增生；而模型组小鼠脾脏组织中出现脾小体增生、融合。见图1。

图1 冠状动脉及脾脏组织HE染色结果（光学显微镜；n=4） 对照组小鼠冠状动脉组织内膜光滑完整，内皮细胞排列整齐，周围无炎性细胞浸润。模型组小鼠冠状动脉组织内膜欠光滑，内皮细胞排列紊乱，周围有大量炎性细胞浸润。对照组小鼠脾小体结构完整，未见增生。模型组小鼠脾脏组织中出现脾小体增生、融合。

2.3 两组小鼠血清中CHI3L1含量比较

模型组血清CHI3L1含量［（4.0±0.7）ng/mL］较对照组［（1.9±0.5）ng/mL］显著升高（t=7.192，P＜0.001，n=8）。

2.4 两组小鼠冠状动脉组织中CHI3L1 和vWF 蛋白在内皮细胞中的定位与变化

免疫荧光染色结果显示，红色为vWF 染色，绿色为α-SMA染色，蓝色为DAPI染色。α-SMA是血管平滑肌的标志物之一，可有效定位血管的结构和分布情况。模型组小鼠冠状动脉组织中vWF表达较对照组降低。见图2。

图2 两组小鼠冠状动脉组织中vWF表达（正置荧光显微镜，×40；n=4） 红色为vWF染色，对照组可见明显红色荧光，模型组红色荧光表达不明显；绿色为α-SMA染色，两组均可见明显绿色荧光；蓝色为DAPI核染色。模型组小鼠冠状动脉组织中vWF表达较对照组降低。

免疫荧光染色结果显示，绿色为CHI3L1染色，红色为α-SMA染色，蓝色为DAPI染色。模型组小鼠冠状动脉组织中CHI3L1表达较对照组升高。见图3。

图3 两组小鼠冠状动脉组织中CHI3L1表达（正置荧光显微镜，×40；n=4） 绿色为CHI3L1染色，对照组绿色荧光不明显，模型组可见明显绿色荧光；红色为α-SMA染色，两组可见明显红色荧光；蓝色为DAPI核染色。模型组小鼠冠状动脉组织中CHI3L1表达较对照组升高。

2.5 两组小鼠冠状动脉组织中CHI3L1 及内皮标志物蛋白的表达

Western blot 结果显示，与对照组相比，模型组冠状动脉组织中CHI3L1 蛋白表达水平升高（P＜0.05），而内皮标志物蛋白vWF 及VE cadherin 蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见表1、图4。

图4 两组小鼠冠状动脉组织中CHI3L1及内皮标志物蛋白表达条带图

2.6 两组小鼠冠状动脉组织中细胞凋亡相关蛋白的表达

Western blot 结果显示，与对照组相比，模型组冠状动脉组织中Bax、Caspase-3蛋白表达水平升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见表2、图5。

表2 两组小鼠冠状动脉组织中细胞凋亡相关蛋白表达水平比较 （xˉ±s，n=6）

图5 两组小鼠冠状动脉组织中细胞凋亡相关蛋白表达条带图

2.7 两组小鼠冠状动脉组织中NF-κB、p-NF-κB蛋白的表达水平变化

Western blot 结果显示，与对照组（0.45±0.09）比较，模型组（0.81±0.06）冠状动脉组织中NFκB蛋白表达水平升高（t=5.851，P=0.004，n=6）；与对照组（0.37±0.15）比较，模型组（1.69±0.12）冠状动脉组织中p-NF-κB 蛋白表达水平升高（t=11.996，P＜0.001，n=6）。见图6。

图6 两组小鼠冠状动脉组织中NF-κB、p-NF-κB蛋白表达条带图

3 讨论

KD 是一种以发热为主要症状的全身性血管炎性疾病，常见于5 岁以下的儿童［10］。该疾病常引起冠状动脉扩张甚至冠状动脉瘤的形成，并可导致远期的心血管后遗症。在西方发达国家及我国大部分地区，CAL 已成为后天获得性心脏病的主要病因［11］。尽管目前IVIG 被广泛用于KD 患儿，10%～20%的KD 患儿对IVIG 治疗无应答，仍有进展为CAL的风险［12］。近年来，针对KD冠状动脉内皮细胞损伤的机制研究成为防治KD血管并发症的理想策略。炎性介质（如白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α 和NF-κB）促进炎症和组织破坏，已成为KD患者CAL中发生内皮细胞功能障碍的重要因素［13］。因此，探讨KD相关炎性因子的作用机制，对精准抗炎治疗和改善CAL 的预后尤为重要。

CHI3L1 属于糖苷水解酶家族18，也被称为YKL-40［14］。该蛋白能够结合壳聚糖、肝素和透明质酸，并受到细胞外基质变化、细胞因子、生长因子、药物以及应激的调控。CHI3L1 由多种细胞产生和分泌，包括巨噬细胞、中性粒细胞和平滑肌细胞等［15］。此外，CHI3L1在多种心血管系统疾病中发挥着重要作用，如冠状动脉粥样硬化和巨细胞动脉炎等［16］。Kwon 等［17］研究发现，CHI3L1在冠状动脉粥样硬化病变中上调，CHI3L1 可以阻止平滑肌细胞向合成和过度增殖状态转换的不良改变，在抑制冠状动脉斑块形成中发挥重要作用［18］。van Sleen等［19］研究表明，在巨细胞动脉炎患者中，CHI3L1可通过与人白细胞介素13受体α2相互作用激活Akt/ERK途径，促进炎症反应、组织破坏和新生血管形成的过程。

单次腹腔注射LCWE可诱发小鼠产生主动脉炎和近端冠状动脉炎，其组织病理学、功能和免疫特征与人类KD中观察到的血管炎非常相似［20］，是目前常见的认可度较高的构建KD样血管炎小鼠模型的方法之一。本研究通过酶联免疫吸附法、免疫荧光染色及Western blot 检测正常对照组小鼠和单次腹腔注射LCWE 构建KD 样血管炎小鼠模型组小鼠冠状动脉组织中CHI3L1 的表达水平，结果显示与对照组小鼠比较，模型组的冠状动脉组织中CHI3L1表达水平明显升高，因此我们推测CHI3L1的过表达可能参与了KD所致CAL的发生。既往研究表明，内皮细胞功能障碍是KD 的关键病理机制［21］。本研究检测了内皮标志物及细胞凋亡蛋白的表达，结果表明KD样血管炎小鼠的冠状动脉组织中，内皮标志物vWF 及VE cadherin 表达水平降低，并且免疫荧光染色结果也显示，对照组小鼠冠状动脉组织中vWF 为高表达，而模型组小鼠冠状动脉组织中vWF基本无表达；细胞凋亡基因Bax及Caspase-3 表达水平明显升高，而抗凋亡基因Bcl-2表达水平明显下降，提示CHI3L1可能通过介导内皮细胞凋亡参与KD 血管炎性损伤。NF-κB 是一种核转录因子，可刺激下游炎症介质表达升高，促进人冠状动脉内皮细胞凋亡，参与KD血管炎症损伤过程［22］。既往研究发现，CHI3L1可通过激活NF-κB 通路促进神经胶质瘤进展［23］。本研究结果表明在KD 样血管炎小鼠的冠状动脉组织中NFκB、p-NF-κB 表达水平升高，提示LCWE 诱导的KD样血管炎可能是通过CHI3L1/NF-κB信号通路造成血管内皮细胞凋亡。

综上所述，LCWE 诱导的KD 样血管炎小鼠模型中CHI3L1 的表达水平升高，可能通过炎性反应介导血管内皮细胞凋亡在冠状动脉损伤中发挥作用。今后将对CHI3L1 是如何通过NF-κB 介导的炎性信号通路来诱发KD血管内皮细胞凋亡进一步研究。本研究为探索CHI3L1 预测KD 患儿发生CAL的潜在生物标志物提供了新的方向。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。