外周血C3aR1及NETs表达水平对脓毒症性凝血病的预测价值

曹锐 刘开勋 胡丹 齐共健

（徐州医科大学附属徐州儿童医院重症医学科，江苏徐州 221002）

脓毒症是宿主对感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍，凝血功能障碍是其常见并发症，合并凝血功能障碍的脓毒症患儿病死率明显增高［1-2］。国际血栓和止血学会（International Society on Thrombosis and Haemostasis, ISTH）于2017 年提出了脓毒症性凝血病（sepsis-induced coagulopathy,SIC）的定义及诊断标准，为临床医师及时识别SIC提供重要依据［3］。SIC是一种复杂性疾病，已有的预测指标普遍存在相对滞后及缺乏特异性等不足，探索能够早期预测脓毒症患儿发生SIC的生物标志物，具有十分重要的临床价值。脓毒症患者中凝血功能紊乱与其过激的免疫反应密切相关。研究显示，脓毒症所致弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation, DIC）患者存在可溶性C5b-C9 水平增高，且补体的激活程度与DIC 的预后相关［4］。补体C3a 受体1（complement-3a receptor 1,C3aR1）为导致严重脓毒症的枢纽基因，参与内皮损伤和炎症风暴发生，目前C3aR1与凝血的相关研究主要集中于冠状动脉疾病及血栓性微血管病［5-7］。中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）作为先天免疫应答的一部分，过度堆积可导致组织损伤及炎性血栓形成，脓毒症患者NETs水平对预测DIC发生具有一定价值［8］。然而，当脓毒症相关凝血功能障碍进展为DIC后，多处于不可逆阶段，错失治疗干预的最佳时机。因此，本研究以免疫血栓形成机制为切入点，探讨患儿外周血C3aR1和NETs水平对SIC的预测价值，以便早期识别高风险患儿，采取相应的干预措施，进而改善疾病预后。

1 资料与方法

1.1 研究对象

前瞻性选取徐州医科大学附属徐州儿童医院2022 年6 月—2023 年6 月收治的78 例脓毒症患儿为研究对象。纳入标准：（1）年龄6个月至14岁；（2）符合2015 年中华医学会发布的《儿童脓毒性休克（感染性休克）诊治专家共识（2015 版）》中儿童脓毒症的诊断标准［9］。排除标准：（1）既往存在血液系统疾病、免疫系统疾病或恶性肿瘤病史；（2）入院前6个月内应用糖皮质激素、免疫抑制剂等；（3）合并其他引起血小板（platelet,PLT）减少的疾病，或服用导致PLT 减少的药物；（4）入院后24 h 内死亡或住院期间放弃治疗；（5）患儿监护人要求退出。本研究经徐州医科大学附属徐州儿童医院伦理委员会评审通过（2023-05-73-H73），经患儿监护人书面知情同意。

1.2 分组

依照2017 年ISTH 发布的SIC 诊断标准［3］，即（1） PLT 计数为（100～150） ×109/L 记1 分，＜100×109/L 记2 分；（2） 1.2＜国际标准化比值（international normalized ratio, INR） ≤1.4 记1 分，INR＞1.4 记2 分；（3） 儿童序贯器官衰竭评分（pediatric Sequential Organ Failure Assessment,pSOFA）≥2 记2 分，pSOFA=1 记1 分。以上3 项评分累计≥4 分诊断为SIC。将78 例脓毒症患儿分为SIC组（36例）与非SIC组（42例）。

1.3 资料收集

收集入组患儿年龄、性别、原发感染部位、入院时体温、入院时心率、pSOFA、PLT 计数、INR、纤维蛋白原（fibrinogen, FIB）、白细胞介素（interleukin, IL） 水平、C 反应蛋白（C-reactive protein, CRP）等数据。

1.4 C3aR1及NETs表达水平检测

入院2 h 内采集外周静脉血2 mL 于EDTA 抗凝管中，离心10 min（3 500 r/min），提取上清液，以-80℃低温冻存。采用酶联免疫吸附法检测血浆标本中C3aR1及NETs表达水平，室温平衡20 min后，向酶标板条内依次加入样本、标准品、生物素化抗体，覆膜以37℃孵育1 h，移去覆膜洗板3 次，加酶结合物工作液，以37℃孵育30 min，洗板5 次，加底物，以37℃孵育15 min，取出酶标板加终止液，以酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度，计算样本浓度。试剂盒由上海江莱生物科技有限公司提供，该试剂盒C3aR1 测定范围为0.15～10 ng/mL，NETs测定范围为0.625～40 ng/mL。

1.5 统计学分析

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以中位数（四分位数间距）［M（Q1，Q3）］表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料采用例数和百分率（%）描述，组间比较采用卡方检验。采用多因素logistic回归分析筛选与SIC发生相关的危险因素。绘制受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve, ROC 曲线）分析C3aR1、NETs 对SIC 的预测价值，采用MedCalc 20.1.0 软件对各指标曲线下面积（area under the cure, AUC）进行Z检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料比较

两组患儿年龄、性别、原发感染部位、入院时体温、入院时心率、pSOFA 评分比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组基线资料比较

2.2 两组实验室数据比较

SIC组患儿INR、CRP、IL-6、IL-10、C3aR1及NETs 水平高于非SIC 组，PLT 计数低于非SIC 组（P＜0.05）。两组患儿FIB、IL-2 及IL-4 水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 两组实验室数据比较 ［M（Q1，Q3）］

2.3 影响SIC发生的多因素logistic回归分析

纳入CRP、IL-6、IL-10、C3aR1 及NETs 进行多因素logistic 回归分析，结果显示C3aR1、NETs及IL-6 升高与SIC 发生密切相关（P＜0.05），见表3。

表3 影响SIC发生的多因素logistic分析

2.4 ROC曲线分析

C3aR1、NETs及IL-6预测SIC发生的AUC值分别为0.779、0.870 和0.760（P＜0.05）。当C3aR1 取最佳截断值4.866 ng/mL时，灵敏度和特异度分别为72.2%和81.0%；当NETs取最佳截断值8.650 ng/mL时，灵敏度和特异度均为83.3%；当IL-6取最佳截断值57.800 pg/mL 时，灵敏度和特异度分别为72.2%和76.2%。C3aR1 联合NETs 预测SIC 的AUC为0.913，灵敏度为83.3%，特异度为95.2%。C3aR1联合NETs预测SIC的AUC高于C3aR1、IL-6的AUC （分别Z=2.039，P=0.041；Z=2.791，P=0.006），与NETs AUC 比较差异无统计学意义（Z=1.733，P=0.083）。见表4。

表4 C3aR1、NETs及IL-6预测SIC的ROC曲线分析

3 讨论

SIC是脓毒症患者的常见并发症，部分患儿可迅速进展为DIC，最终导致多脏器衰竭甚至死亡［10］。SIC的发病机制复杂，凝血系统的紊乱与炎症反应、补体系统的异常激活密切相关［11］。早期凝血紊乱具有隐匿性，目前缺乏早期预测凝血障碍发生的生物学指标［12］。因此，寻找早期预测SIC发生的生物学指标具有重要临床价值。

发生脓毒症时，过敏毒素（C3a 和C5a）大量释放会导致炎症风暴及内皮损伤，与凝血功能障碍密切相关［13-14］。在炎症反应过程中，C3aR1与补体C3a特异性结合，通过PLC-PKC信号通路引起细胞内钙流的改变，发挥趋化效应，诱导端粒酶释放及氧自由基的产生，介导血管内皮细胞损伤，促进血栓形成［15-16］，推测C3aR1的高表达与SIC的发生具有一定关系。NETs 是中性粒细胞接受刺激后形成释放的胞外结构［17］，Varjú 等［18］证实，NETs 及其组分可直接参与血凝块的形成并改变血凝块中纤维蛋白的结构，降低血凝块对组织型纤溶酶原激活物的敏感性，发挥抑制纤溶作用。Pieterse 等［19］发现，脓毒症中NETs 过度产生可能导致细胞毒性而损伤内皮细胞。由此推测NETs 在SIC的发生发展中起重要作用。本研究受试者为儿童，故采用pSOFA 量表，评价脓毒症患儿的疾病严重程度和器官损伤情况［20］。

本研究中，SIC 组C3aR1 和NETs 水平高于非SIC组，多因素logistic回归分析显示C3aR1、NETs与SIC 的发生密切相关。Propson 等［21］研究证实，内皮细胞中激活的C3a-C3aR1信号转导可以引起淋巴细胞浸润，触发血管细胞黏附分子1 的分泌增加，由此分析C3aR1 的高表达可能通过促进血管功能的炎症转变，导致SIC的发生。Sauter 等［6］研究表明在冠状动脉疾病中，C3aR1表达与血栓中活化PLT 表面糖蛋白IIb/IIIa 受体的共表达呈强正相关，C3aR1通过调节Ras相关蛋白1b的激活促进血栓形成，脓毒症过程中同样存在过激的炎症反应与内皮损伤，提示C3aR1可能通过诱导PLT过度活化、激活与血栓形成相关的细胞信号通路，增加SIC发生的风险。Abrams等［8］研究发现，DIC患者血浆诱导的NETs 形成显著高于非DIC 患者，本研究结果与之相符。Alsabani 等［22］通过动物实验显示抑制CXC 趋化因子受体1/2 减少NETs 的生成可以降低脓毒症小鼠血管功能障碍的发生。由此可见NETs 过度释放可导致血管内皮损伤，促进PLT聚集和免疫血栓形成，增加SIC发生的风险。

进一步绘制ROC曲线评估C3aR1、NETs及IL-6对SIC的预测价值，结果显示C3aR1联合NETs预测SIC 的价值高于C3aR1 与IL-6 单独检测，与NETs单独预测价值相当。鲁海艳等［23］发现IL-6在预测脓毒症并发凝血功能障碍中的AUC 为0.716，其特异度为87.5%，本研究结果与之相似。俞秋兴等［24］研究显示，NETs相关标志物预测脓毒症相关凝血功能障碍的AUC 可达0.97，本研究结果与之相符，均提示NETs 在预测脓毒症并发的凝血性疾病中的重要价值。本研究采用的是SIC 诊断标准，Yamakawa 等［25］研究表明SIC 相较脓毒症相关凝血功能障碍更有益于指导脓毒症早期抗凝治疗。

综上所述，SIC 中C3aR1 及NETs 表达水平显著增高，检测C3aR1 及NETs 水平对预测SIC 发生具有重要临床价值。本研究作为一项单中心前瞻性研究，样本量数量偏少，有待进一步扩大样本量完善研究。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突关系。