外周血淋巴细胞亚群对静脉注射免疫球蛋白无反应型川崎病患儿的预测价值

薛燕 尹晶 许俐 党利亨 王朝 崔亚琼 张新杰 李崇巍

（1.天津市儿童医院（天津大学儿童医院）天津市儿科研究所/天津市儿童出生缺陷防治重点实验室，天津 300134；2.天津市儿童医院（天津大学儿童医院）风湿免疫科，天津 300134）

川崎病（Kawasaki disease, KD）是一种急性免疫性血管炎性疾病，心血管系统受累在KD中表现突出，以冠状动脉病变（coronary artery lesion,CAL）最为多见，已成为儿童后天性心脏病的最常见病因［1］。 目前， 静脉注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin, IVIG）联合阿司匹林是KD 的标准治疗，但仍有10%～20%的患儿对该治疗无反应，其CAL 发生率较IVIG 敏感患儿明显升高［2］。早期识别IVIG 无反应患儿，有助于尽早采取积极的强化治疗，从而降低IVIG 耐药率和CAL发生率，改善患儿预后［3-4］。

目前KD的发病机制尚不清楚，但在疾病的急性期能观察到中性粒细胞比例和绝对计数增多，以及淋巴细胞比例和绝对计数减少，因此固有免疫与适应性免疫的不平衡被认为是KD的关键致病因素［5-6］。淋巴细胞亚群作为适应性免疫的重要组成部分，是评估细胞免疫和体液免疫功能的重要指标。与正常对照相比，急性KD患儿外周血中B、T细胞等显著降低，可以选择性地从外周血招募到冠状动脉，从而引起CAL［7］。有研究表明，淋巴细胞亚群参与多种免疫性疾病的发生发展，可用于监测自身免疫性疾病的病情进展和治疗转归［8］。淋巴细胞亚群在IVIG 无反应型与IVIG 敏感型KD之间存在显著差异，但其在IVIG无反应型KD预测体系中的作用尚未见报道。本研究就治疗前外周血淋巴细胞亚群在IVIG无反应型KD中的特征及其在IVIG无反应型KD早期预测中的临床价值进行探讨，建立IVIG无反应型KD的早期预测模型，并评估其预测效能。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性纳入2021年1月—2023年3月期间在我院住院的KD 患儿226 例。纳入标准：（1）根据2017年美国心脏协会的标准诊断的完全性KD或不完全性KD［9］；（2）发病10 d 内入院，且首次治疗均为IVIG（2 g/kg）；（3）临床资料完整，且治疗前采集外周血进行淋巴细胞亚群检测。排除标准：（1）复发KD、KD休克综合征；（2）合并有其他自身免疫疾病、血液疾病或恶性肿瘤等；（3）患儿于外院确诊KD，且诊疗过程已使用IVIG治疗。

IVIG无反应型KD诊断标准：首次IVIG输注结束后36 h，患儿仍有持续发热的表现，或在治疗2～7 d后再次出现发热并伴随至少1种以上的KD临床症状［9］。根据此标准，将纳入对象分为IVIG 敏感组（185例）和IVIG无反应组（41例）。

另选取同期0.5～5岁的健康儿童46例作为对照组，其年龄和性别构成与KD组相匹配。

1.2 临床资料收集

（1）一般资料：年龄、性别和发病时间等。

（2）IVIG 治疗前常见实验室检查指标：中性粒细胞比例（neutrophil percentage, N%）、血小板计数（platelet count, PLT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase, AST）、 谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、球蛋白（globulin, GLB）、白蛋白（albumin, ALB）、血清钠（serum sodium,Na+）、总胆红素（total bilirubin, TB）、C 反应蛋白（C reactive protein, CRP）、铁蛋白（ferritin, Ferr）、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate,ESR）、白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）。

1.3 淋巴细胞亚群检测

所有患儿治疗前予EDTA 抗凝管静脉采血2 mL， 采用流式细胞仪FACScanto Ⅱ（BD Bioscience，美国）、BD multitest 6-color TBNK 试剂（BD Bioscience，美国）及绝对计数微球试剂盒（北京同生时代，中国）检测淋巴细胞亚群，包括总T 细胞（CD3+）、CD4+T 细胞（CD3+CD4+）、CD8+T 细胞（CD3+CD8+）、B 细胞（CD3-CD19+）和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK 细胞）（CD3-CD16+/CD56+）的比例和绝对计数。

1.4 5种不同预测评分体系

应用Kobayashi 等［10］、 Egami 等［11］、 Sano等［12］、Yang等［13］、Wu等［14］5种评分体系（表1），对本研究226 例KD 患儿进行评分，分别计算各个评分体系对本研究中IVIG无反应型KD患儿预测的灵敏度和特异度。

表1 5种不同预测评分体系

1.5 统计学分析

使用SPSS 26.0 统计软件对数据进行统计学分析。呈正态分布的计量资料以均值±标准差（xˉ±s）表示，组间比较采用两样本t检验；非正态分布资料以中位数（四分位数间距）［M（P25，P75）］表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料以频数和百分率（%）表示，组间比较使用卡方检验。将单因素分析后P＜0.05 的变量纳入多因素logistic回归分析，评估IVIG无反应型KD的预测因素。为了便于操作，对每个预测因素进行赋值以建立一个简化的预测评分体系［14］。

2 结果

2.1 研究对象的一般资料

共226例KD患儿纳入研究，其中IVIG敏感组185 例，IVIG 无反应组41 例。IVIG 敏感组中，女性73 例（39.5%），男性112 例（60.5%），中位发病年龄2（1，3）岁。IVIG 无反应组41 例，其中女性19例（46.3%），男性22例（53.7%），中位发病年龄2（1，3）岁。两组之间年龄、性别的比较差异无统计学意义（分别P=0.795、0.417）。

对照组共46 例，其中男性31 例（67.4%），女性15 例（32.6%），中位年龄2（1，3）岁。KD 组共226 例，其中男性134 例（59.3%），女性92 例（40.7%）。两组年龄、性别的比较差异无统计学意义（分别P=0.599、0.305）。

2.2 IVIG敏感组和IVIG无反应组常见临床数据的比较

与IVIG 敏感组相比，IVIG 无反应组Ferr、IL-6、AST、ALT、TB、N%及CRP 显著升高，Na+、GLB 及PLT 显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组其余指标的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 IVIG敏感组和IVIG无反应组常见临床数据的比较

2.3 KD组与对照组淋巴细胞亚群的比较

与对照组相比，KD组B细胞比例及CD4+/CD8+比值显著升高（P＜0.05），总T 细胞、CD8+T 细胞、NK 细胞的比例显著下降（P＜0.05）；KD 组总T 细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞的绝对计数均明显低于对照组（P＜0.05）。见表3。

表3 KD组和对照组淋巴细胞亚群的比较 ［M（P25，P75）］

2.4 IVIG无反应组和IVIG敏感组淋巴细胞亚群的比较

IVIG无反应组总T细胞和CD4+T细胞的比例明显低于IVIG 敏感组（P＜0.05）；IVIG 无反应组总T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞及NK细胞的绝对计数明显低于IVIG敏感组（P＜0.05）。两组其余指标的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 IVIG敏感组和IVIG无反应组淋巴细胞亚群的比较 ［M（P25，P75）］

2.5 多因素logistic回归分析

单因素分析后，将IVIG 敏感组与IVIG 无反应组之间差异有统计学意义的变量（P＜0.05）纳入多因素logistic 回归分析，共纳入17 个连续变量作为自变量，包括10 个常见实验室检查指标（Ferr、IL-6、Na+、AST、ALT、GLB、TB、N%、PLT、CRP） 及7 个淋巴细胞亚群指标（总T 细胞和CD4+T 细胞比例，以及总T 细胞、CD8+T 细胞、CD4+T 细胞、NK 细胞、B 细胞绝对计数），以患儿对IVIG 治疗的敏感性为因变量。多因素logistic 回归分析显示，CD4+T 细胞绝对计数、NK 细胞绝对计数、Na+、GLB和TB这5个变量是IVIG无反应型KD 的预测因素（P＜0.05），见表5，并建立logistic回归模型：Y（X）=26.863-0.001X1（CD4+T 细胞绝对计数）+0.002X2（NK细胞绝对计数）-0.193X3（Na+）-0.117X4（GLB）+0.078X5（TB）。受试者操作特征曲线 （receiver operating characteristic curve， ROC 曲线）分析显示，以模型得分≥-1.51为截断值，该模型预测IVIG 无反应型KD 的灵敏度、特异度分别为70.7%、78.9%，约登指数为0.496，曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.801（95%CI：0.725～0.878）。

表5 IVIG无反应型KD影响因素的logistic回归分析

2.6 简化评分体系

根据ROC 曲线分析结果，将以上logistic 回归模型中的5个变量转化为二分类变量，再次进行多因素logistic 回归分析。各变量的截断值如下：CD4+T 细胞绝对计数≤960.9 个/μL，NK 细胞绝对计数≤157.2 个/μL，Na+≤135 mmol/L，GLB≤22.4 g/L，TB≥5.9 μmol/L。多因素logistic回归分析结果显示，CD4+T细胞绝对计数≤960.9个/μL，Na+≤135 mmol/L，GLB≤22.4 g/L，TB≥5.9 μmol/L 为IVIG 无反应型KD的预测因素。根据各预测因素的OR值对变量赋分（表6），建立评分体系：CD4+T 细胞绝对计数≤960.9 个/μL 为3 分，Na+≤135 mmol/L 为3 分，GLB≤22.4 g/L为3分，TB≥5.9 μmol/L为5分。ROC曲线分析显示，总分≥11分为截断值时，此评分体系预测IVIG无反应型KD的约登指数最大（0.545），灵敏度、特异度分别为70.7%、83.8%，AUC为0.816（95%CI：0.745～0.888），见表7和图1。

图1 预测IVIG无反应型KD的ROC曲线

表6 多因素logistic回归法分析IVIG无反应型KD的预测指标

表7 不同截断值下本研究建立的预测评分体系的预测效能

2.7 与已有的5种评分体系预测IVIG无反应型KD的预测效能的比较

将5 种国内外评分体系［10-14］分别应用于本研究的226 例KD 患儿，对IVIG 无反应型KD 进行预测。结果显示，Sano 评分［12］、Yang 评分［13］、Wu评分［14］的灵敏度均低于50%，Kobayashi 评分［10］和Egami评分［11］的特异度均低于75%，5种评分体系的约登指数均低于0.4（范围：0.174～0.358）。与以上5种评分体系相比，本研究建立的评分体系的灵敏度和特异度明显增高，约登指数为0.545，见表8。

表8 6种评分体系对IVIG无反应型KD的预测效能

3 讨论

现有IVIG无反应型KD评分体系主要基于临床特点和炎症指标所构建，缺乏免疫指标，存在灵敏度不高的缺陷。KD作为一种急性的自身免疫性血管炎，免疫机制在其中发挥着重要作用。KD发病初期存在免疫细胞活化，免疫指标的引入或许能增加预测体系的效能。因此本研究检测总T 细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞及NK细胞在急性期治疗前的表达水平，结合现有评分体系提示的多个预测因素，构建预测评分体系，探讨其在IVIG无反应型KD预测中的作用。

近年越来越多的证据表明，固有免疫与适应性免疫的不平衡是KD的关键致病因素［7，15］。目前KD患儿外周血中总淋巴细胞比率和绝对计数减少已成共识［16-17］，但各淋巴细胞亚群的变化趋势仍有争议，尤其是B细胞和T细胞亚群的比例及绝对计数［18-20］。为此，2022 年Xie 等［7］通过生物信息学方法，收集高通量基因表达数据库中所有KD相关数据集，分析101个健康儿童及480个急性期KD患儿的资料，归纳淋巴细胞亚群比例和绝对计数的变化趋势，建立KD外周血免疫细胞图谱，显示KD患儿外周血中总T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B 细胞的比例和绝对计数均明显低于健康儿童，NK细胞的绝对计数明显低于健康儿童。本研究中淋巴细胞亚群（除B细胞外）的绝对计数结果与之一致；总T 细胞、CD8+T 细胞、NK 细胞比例结果也与之一致，不同在于本研究中KD 患儿CD4+T 细胞比例与健康对照相比没有显著差异，B细胞比例则明显高于健康儿童。这可能是由于细胞比例易受个体的亚群及总淋巴细胞两者降低程度的影响，导致结果不稳定。因此，我们认为淋巴细胞亚群绝对计数更能客观反映免疫细胞变化趋势。此外，KD患儿的各淋巴细胞亚群绝对计数还与IVIG 敏感性有关。本研究结果表明IVIG 无反应型KD 患儿治疗前的总T 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、NK 细胞及B 细胞绝对计数明显低于IVIG 敏感型，与国内外研究结果［18，20］基本一致，但能否作为预测IVIG 治疗反应的潜在生物标志物尚缺乏研究。

在本研究建立的评分体系中，CD4+T细胞绝对计数≤960.9 个/μL 为KD 患儿IVIG 无反应的预测因素。既往研究发现KD小鼠模型中早期损伤的冠状动脉壁可见大量CD4+T细胞浸润，而正常小鼠冠状动脉中未见到CD4+T细胞［6］，提示CD4+T细胞参与KD 急性期的血管壁炎症反应，导致外周血中CD4+T 细胞过度消耗。而本研究发现IVIG 无反应组外周血中CD4+T细胞绝对计数低于IVIG敏感组，推测IVIG 无反应组有更多CD4+T 细胞参与血管壁的炎症反应。在本研究建立的logistic回归模型中，除了CD4+T 细胞绝对计数，NK 细胞绝对计数也是IVIG无反应的预测因素。Choi等［21］发现在诊断时（IVIG 输注之前），IVIG 无反应型KD 患者的CD56-CD16+亚型NK 细胞水平明显低于IVIG 敏感型，且其水平与IVIG 反应性、发热持续时间、CAL 以及颈部淋巴结等临床表现相关，也与氨基酸B型钠尿肽前体、CRP和ALT水平以及淋巴细胞和中性粒细胞计数有关。但需要进一步的研究来验证CD56-CD16+亚型NK 细胞的KD 特异性，特别是在IVIG治疗的背景下，并阐明NK细胞受体表达和功能失调的分子机制。

已有研究表明淋巴细胞亚群绝对计数对儿童难治性肺炎支原体肺炎具有早期预测作用［22］。本研究将淋巴细胞亚群绝对计数纳入IVIG 无反应型KD 预测评分体系中，建立的评分体系包括接受IVIG 治疗前的4 个变量：CD4+T 细胞绝对计数≤960.9/μL（3 分）、Na+≤135 mmol/L（3 分）、GLB≤22.4 g/L（3 分）、TB≥5.9 μmol/L（5 分）。当总分≥11分时，KD患儿被认定为IVIG耐药的高危人群，应警惕IVIG 治疗可能无反应。此评分体系预测IVIG无反应型KD的AUC、灵敏度和特异度分别为0.816、70.7%和83.8%，预测效能优于其他5 种国内外评分体系［10-14］。

本研究为单中心回顾性研究，可能存在选择偏倚，这是本研究的局限性。另外，本研究建立的IVIG无反应型KD的预测评分体系的效能需要进一步内部验证和外部验证。因此，未来的研究应着重于前瞻性的随机对照研究，以优化预测模型，并需要更严格的内部和外部验证。

综上所述，本研究显示，外周血淋巴细胞亚群的检测可在预测IVIG无反应型KD中发挥重要作用。本研究基于外周血淋巴细胞亚群及常见实验室检查指标建立的预测评分体系可用于预测KD患儿是否对IVIG 有反应，与目前使用的风险评分体系相比，具有更好的准确性，对指导临床医生选择合适的个体化治疗以减少KD患儿CAL的发生具有重要意义。

利益冲突声明：所有作者声明无利益冲突。