血清miRNA210、miRNA155 表达水平对NSCLC的诊断价值

余桂东，余桂永，马旭晓

（1.河南省南阳市宛城疾病预防控制中心结防科，河南 南阳473000；2.河南省南阳市西峡县人民医院肿瘤科，河南 南阳474550；3.河南省南阳市宛城疾病预防控制中心慢病科，河南 南阳 473000）

流行病学研究表明非小细胞肺癌 （NSCLC）的发病率可达848/10 万人左右[1]，且致残率、病死率均较高[2]。 早期诊断NSCLC，能为临床诊疗尤其是手术治疗提供契机。 微小RNA210（miRNA210）能够通过影响癌基因的扩增速度， 加剧癌基因的转录活性， 最终促进肿瘤细胞的异常分裂和增殖[3]；微小RNA155（miRNA155）能够对癌细胞内肿瘤蛋白的翻译产生影响，加剧肿瘤信号通路的上调，影响到肿瘤细胞的浸润和黏附过程[4]。 为揭示血清miRNA210、miRNA155 在NSCLC 患者中的表达情况， 本研究收集我院2016 年3 月至2018 年9 月间经病理学检查证实为NSCLC 的患者、 肺部良性病变患者以及健康人群的临床资料，分析血清miRNA210、miRNA155 的表达情况及其诊断学价值，为NSCLC 的临床诊疗提供参考，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016 年3 月至2018 年9 月间我院经病理学检查证实为NSCLC 的患者60 例作为NSCLC 组、肺部良性病变患者60 例作为良性组、60 例健康体检对象作为对照组。 NSCLC 组，年龄44~75 岁，平均（57.0±9.6）岁；男性37 例、女性23 例。TNM 分期[6]：Ⅰ期14 例、Ⅱ期29 例、Ⅲ期15例、Ⅳ期2 例。 肿瘤分化程度：高分化14 例、中分化27 例、低分化19 例。有淋巴结转移37 例。肿瘤直径大于等于3 cm 29 例、小于3 cm 31 例。 良性组，年龄44~75 岁，平均（56.1±9.0）岁；男性34 例、女性26 例；其中肺结核39 例、肺纤维瘤10 例、肺部炎性结节11 例。 对照组，年龄40~75 岁，平均（55.2±11.3）岁；男性32 例、女性28 例。 三组研究对象的年龄、性别差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 纳入标准与排除标准 纳入标准：（1）NSCLC组患者符合 《中华医学会肺癌临床诊疗指南》中NSCLC 诊断标准[6]；（2）患者经胸部CT、MRI 及纤维支气管镜活检证实；（3）术后均接受病理学检查；（4）患者在检查前无放化疗及免疫治疗史；（5）对照组为健康体检志愿者；（6）均签订知情同意书自愿参与本次研究，并经我院伦理委员会审核批准。 排除标准：（1） 患者合并机体其他系统或部位的肿瘤；（2）病理学资料缺失；（3）伴有风湿性疾病、免疫性疾病等。

1.3 检测方法 采集研究对象清晨空腹静脉血5 mL于抗凝管中，加入0.3 mL 氯仿，室温下震荡30 s，放置30 min， 取上层清亮液体1 mL 移入另一EP管，加入等体积的异丙嗪溶液，室温放置30 min，1 000 r/min 离心10 min， 取沉淀物为RNA， 加入75%乙醇溶液1 mL，溶解后1 000 r/min 离心10 min，取上清液，加入20 μL DEPC 水计算RNA 浓度，单位为：μg/μL。 采用SuperScript Ⅳ逆转录试剂盒（Invitrogen SuperScript Ⅳ反转录酶购自赛默飞公司）进行cDNA 合成，以cDNA 为模板按qRT-PCR仪器及试剂盒（CISILE2018 高通量PCR 仪器购自常州福生生物技术有限公司， 试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司） 说明书进行反应合成miRNA210、miRNA155。反应条件：预变性94 ℃4 min，目的片段扩增94 ℃30 s，退火60 ℃1 min，延伸72 ℃30 s，共35 个循环。 miRNA210 引物序列：上游 5' -GACGTACTGTGGAAGT -3'， 下 游 5' -CGTCGCGACAAGACGTAGTCA-3'；β-actin 引 物序列：上游5'-CGAGCCGATCGCAGAGCGC-3'，下游5'-GCATAACATGCGTCTGTGAT-3'。miRNA155引物序列： 上游5'-GTCCATCAGTGGTAGT-3'，下游5'-CCAAGTCAGATGTCCAAGACTTG-3'。 βactin 引物序列：上游5'-CTTACGCAACTGAGTCCCC-3'， 下游5'-ATCTGACTAGTGACTATCAT-3'。以β-actin 为内参，2－△△Ct法分别计算miRNA210和miRNA155 相对表达强度。

1.4 统计处理方法 采用SPSS 21.0 版本统计学软件对相关数据进行分析，计量资料用（±s）来描述，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析及两两比较的LSD-t检验；计数资料用（%）表示，采用χ2检验；绘制ROC曲线分析血清miRNA210、miRNA155 表达水平单独及联合应用对NSCLC 与肺部良性病变的鉴别诊断效能。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组研究对象血清miRNA210、miRNA155 水平比较 经单因素方差分析，三组血清miRNA210、miRNA155 水平差异均有统计学意义 （P<0.05）。NSCLC 组患者血清miRNA210、miRNA155 水平显著高于良性组和对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）； 良 性 组 和 对 照 组 血 清miRNA210、miRNA155 水平差异无统计学意义（P>0.05）。 见表1。

表1 三组研究对象的血清miRNA210、miRNA155水平比较（±s，相对表达强度）

表1 三组研究对象的血清miRNA210、miRNA155水平比较（±s，相对表达强度）

注：与NSCLC 组比较，*P<0.05。

组别NSCLC 组良性组对照组n miRNA210 60 60 60 F P 1.741±0.528 1.008±0.394*1.001±0.280*63.518<0.001 miRNA155 5.205±1.810 1.962±0.774*1.881±0.559*154.544<0.001

2.2 血清miRNA210、miRNA155 水平与NSCLC 病理特征的关系 不同TNM 分期、 有无淋巴结转移的NSCLC 患者血清miRNA-210 水平差异有统计学意义（P<0.05），不同TNM 分期的NSCLC 患者血清miRNA-155 水平差异有统计学意义（P<0.05）；见表2。

表2 血清miRNA210、miRNA155 水平与NSCLC 病理特征的关系（±s，相对表达强度）

表2 血清miRNA210、miRNA155 水平与NSCLC 病理特征的关系（±s，相对表达强度）

因素TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期Ⅲ期+Ⅳ期病理学类型鳞癌腺癌淋巴结转移n miRNA210 t P miRNA155 t P 4.616<0.001 3.260 0.002 43 17 1.551±0.516 2.188±0.377 4.782±1.735 6.390±1.687 0.350 0.728 0.438 0.663 12 48 1.712±0.471 1.767±0.491 5.101±1.700 5.351±1.784 2.912 0.005 0.484 0.630是否37 23 1.901±0.500 1.519±0.484 5.361±1.790 5.144±1.511分化程度高分化+中分化低分化41 19 1.719±0.512 1.820±0.477 0.726 0.471 5.115±1.765 5.430±1.531 0.669 0.506

2.3 血清miRNA210、miRNA155 单独及联合应用鉴别诊断NSCLC 与肺部良性病变的价值ROC曲线分析结果显示， 血清miRNA210、miRNA155 单独检测对NSCLC 与肺部良性病变均具有较好的鉴别诊断价值（AUC＞0.7），miRNA210 的灵敏度略高于miRNA155，而特异度略低于miRNA155；血清miRNA210、miRNA155 联合应用鉴别诊断NSCLC与肺部良性病变的AUC明显高于二者单独检测，且灵敏度、特异度均高于单独检测；见表3、图1。

图1 血清miRNA210、miRNA155 水平单独及联合应用鉴别诊断NSCLC 与肺部良性病变的ROC

表3 血清miRNA210、miRNA155 单独及联合应用鉴别诊断NSCLC 与肺部良性病变的价值

3 讨论

临床观察发现，NSCLC 患者术后无瘤生存时间及总体生存时间均较短，5 年生存率也较低[7]。而多数NSCLC 患者往往在诊断时，已处于中晚期，常已错过进行根治性手术的最佳时机。 因此，NSCLC的早期诊断可能对提高临床疗效、 延长生存时间具有重要意义，也是目前临床研究的重点和难点。影像学检查对NSCLC 具有一定的诊断价值， 但其对早期肺癌或者微小浸润癌的筛查效果并不理想。 癌胚抗原、糖链蛋白199 等肿瘤标志物，对呼吸系统恶性肿瘤具有一定的诊断价值， 但其对NSCLC 诊断的灵敏度、特异度均较低，存在明显的局限[8-9]。 微小RNA 的改变，能够在自身免疫性疾病、炎症反应及恶性肿瘤的发生过程中发挥作用，其可通过对癌基因激活调控、 肿瘤蛋白的转录翻译和肿瘤信号通路的影响， 最终提高癌细胞的DNA 分裂水平[10-12]。 本研究通过对NSCLC 患者血清不同微小RNA 水平进行分析研究， 旨在为NSCLC 的早期诊断提供新的研究方向和临床参考。

miRNA210 能够提高癌细胞的伪足形成风险，促进肺泡上皮细胞的迁移和浸润能力；miRNA155是基因转录调控成员， 其通过对转录上游启动子活性的影响，加快肿瘤细胞骨架蛋白的合成速度[13-14]。miRNA210、miRNA155 的高表达，能在肿瘤细胞生物学行为改变、 癌细胞内第二信使激活或者肿瘤细胞上皮-间质转换等方面发挥作用，最终增加早期肺泡上皮细胞异常分裂的风险， 促进中晚期肺癌细胞的转移和浸润[15]。 有研究发现，肺癌患者血清miRNA210 基因的表达扩增水平可上升40%以上， 而癌细胞转移风险较高或者肺部多发转移的患者， 血清miRNA210 基因的扩增水平常进一步上升[16-17]。 本研究结果发现，不同TNM 分期及有无淋巴结转移NSCLC 患者血清miRNA210 表达，以及不同TNM 分期NSCLC 患者血清miRNA155 表达均存在显著差异（P＜0.05），与以往的研究结论类似， 提示血清miRNA210、miRNA155 表达与NSCLC 的发生发展密切相关。 分析原因可能与miRNA210、miRNA155 可能作为致癌基因参与并促进NSCLC 血管生成和肿瘤的生长转移，而miRNA210 也可能通过调节微环境下肿瘤细胞呼吸功能，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移有关[18-19]。

本研究进一步通过绘制ROC曲线对血清miRNA210、miRNA155 对NSCLC 的诊断临界值及诊断效能参数进行定量分析，结果显示，血清miRNA210、miRNA155 单 独 检 测 对NSCLC 与 肺 部 良性病变均具有较高的鉴别诊断价值 （AUC＞0.7），miRNA210 鉴别诊断的灵敏度较高，而miRNA155鉴别诊断的特异度高。 二者联合检测鉴别诊断NSCLC 和肺部良性病变的AUC、灵敏度、特异度均较单独检测有不同程度提高， 提示血清miRNA210、miRNA155 联合检测有利于提高NSCLC的临床诊断效能， 降低漏诊率和误诊率， 提高了NSCLC 诊断的科学性。

综上所述，NSCLC 患者血清miRNA210、miRNA155 表达明显升高， 且与临床分期和淋巴结转移具有一定的相关性，血清miRNA210、miRNA155定量检测对NSCLC 诊断具有一定的临床价值，而二者联合检测能进一步提高NSCLC 的临床诊断效能。