芍药苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化及PI3K/AKT通路的影响*

孙 韬,宋 爽,陈 磊,李宁宁△

(河南医学高等专科学校 a.临床医学院;b.基础医学部;c.人事处,郑州 451191)

肾脏纤维化是多种慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)的基本病理过程,纤维化过程会逐渐损害肾脏功能直至肾功能完全丧失,最终导致终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)[1]。ESRD患者不断增加,给社会和家庭带来沉重的经济负担,严重威胁人类健康[2]。转化生长因子-β1(transforming growth factor-1,TGF-β1)是促进纤维化进展的重要因子[3],在细胞外基质过度沉积中起着至关重要的作用,其表达水平与肾纤维化程度呈正相关[4]。肾纤维化是由多个信号转导通路和多因素参与的复杂过程。磷酸酰肌醇3激酶 (phosphoinositol 3 kinase,PI3K)是与质膜相关的脂质激酶,受到生长因子等刺激时,激活并与丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine protein kinase,AKT)的PH结构域以及磷酸肌醇依赖性蛋白激酶结合,促使AKT从细胞质中募集到细胞膜上,发生构象变化和双磷酸化,活化的AKT继续作用下游靶蛋白,在细胞增殖、细胞凋亡、上皮间质转分化及炎症反应等多个过程中发挥关键作用[5-6]。

芍药苷(paeoniflorin,PF)是中药芍药的主要活性成分,为水溶性单萜类糖苷化合物,毒副作用低,在体内外具有广泛的药理作用,如抗炎、抗氧化、免疫调节等[7-8]。PF对肾纤维化的作用研究较少,本研究以人肾近曲小管上皮细胞HK-2为研究对象,使用TGF-β1刺激诱导细胞制备肾纤维化模型,观察PF作用细胞后的变化,探讨PF对肾纤维化的作用及具体作用机制,寻找肾纤维化可能的治疗靶点,为肾纤维化的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 HK-2细胞购于中国科学院上海细胞库,PF[成都乐美天医药科技有限公司(纯度≥98),DSTDS007002],TGF-β1(MCE,HY-P7118),DMEM高糖培养基(北京索莱宝生物科技有限公司,12100),胰蛋白酶(北京索莱宝生物科技有限公司,T1300),南美胎牛血清(Prime,FSP500),细胞毒性实验(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒(GLPBIO,GK10001),α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗体(CST,19245S),上皮钙黏素(epithelial cadherin,E-cad)(CST,14472S),PI3K抗体(CST,4257F),p-PI3K抗体(CST,278545),AKT抗体(武汉三鹰生物科技有限公司,60103-2-Ig),p-AKT抗体(武汉三鹰生物科技有限公司,28731-1-Ap)。

1.2 仪器与设备 CO2培养箱(HealForce,HF90),高速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司,TGL6A),掌上离心机(武汉赛维尔生物科技有限公司, TGL6A),倒置显微镜(徕卡,DMi1),酶标仪(BioTek,epoch2),近红外双色激光成像系统(Li-COR,2800)。

1.3 方法

1.3.1 细胞复苏和培养 液氮罐中取出冻存细胞,快速放入37 ℃水浴中复苏。转移细胞悬液至离心管中,加等体积完全培养基重悬,1 000 rpm离心5 min,弃上清液,加2 mL完全培养基重悬细胞,转至培养瓶中,加3 mL完全培养基,放37 ℃、5% CO2培养箱中培养、传代。收集细胞种于12孔板,每孔浓度1×105个,加1 mL完全培养基,37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养过夜。

1.3.2 CCK8检测细胞的活性 将细胞接种于96孔板,每孔4×103个,每孔中各加入100 μL完全培养基,于37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。分别加入不同浓度TGF-β1(1.25、2.5、5、10、20 μg·L-1)和PF(10、20、40、80、160 μM),每组6个复孔,继续培养6、12、24、48、72 h。各孔分别加入10 mL CCK-8溶液, 1.5 h后,用酶标仪在波长为450 nm时测定吸光度值。

1.3.3 实验分组 对照组:加入与实验组TGF-β1和PF相同体积的PBS;模型组:加10 μg·L-1TGF-β1;PF低剂量组:20 μM PF干预2 h后,加10 μg·L-1TGF-β1;PF高剂量组: 80 μM PF干预2 h后,加10 μg·L-1TGF-β1,均作用48 h。

1.3.4 蛋白免疫印迹(Western blot)检测α-SMA、E-cad、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达 冰上用全细胞裂解液裂解细胞,隔5 min振荡1次,共振荡5次,12 000 g, 4 ℃离心10 min,取上清液得到总蛋白。BCA测蛋白浓度后配置上样体系,10% SDS-PAGE凝胶电泳2.5 h,转膜1.5 h,3.5%的牛血清白蛋白室温封闭2 h,4 ℃过夜分别孵育一抗α-SMA、E-cad、p-PI3K、PI3K、p-AKT、 AKT,TBST清洗条带3次,每次10 min,室温孵育二抗2 h,TBST清洗条带3次,每次10 min,曝光显影,计算灰度值。

2 结果与分析

2.1 TGF-β1对HK-2细胞活力的影响 CCK-8结果显示,与TGF-β1浓度0 μg·L-1组比较,各浓度TGF-β1对HK-2刺激6 h和12 h,对细胞活力无影响;刺激24 h,20 μg·L-1TGF-β1对细胞活力有显著抑制作用(P<0.01);刺激72 h,浓度≥2.5 μg·L-1TGF-β1对细胞活力有显著抑制作用(P<0.05 或<0.01)。因此,本实验选取10 μg·L-1浓度的 TGF-β1刺激48 h进行细胞纤维化造模后续实验。见图1。

注:与TGF-β1 0 μg·L-1组比较,*:P<0.05,**:P<0.01。

2.2 PF对HK-2细胞活力的影响 CCK-8结果显示,与PF 0 μM组比较,PF刺激6 h对HK-2细胞活力无影响;刺激12 h,160 μM PF对HK-2细胞活力有抑制作用(P<0.05);刺激72 h,浓度>20 μM 的PF对细胞活力有显著抑制作用(P<0.05或<0.01)。因此,本实验选取20 μM、80 μM浓度的PF干预48 h进行后续实验。见图2。

注:与PF 0 μM组比较,*:P<0.05,**:P<0.01。

2.3 PF对TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化因子α-SMA和E-cad表达的影响 TGF-β1刺激48 h,与对照组比较,α-SMA表达升高(P<0.01),E-cad表达降低(P<0.01),提示TGF-β1诱导HK-2细胞纤维化造模成功。经过20 μM、80 μM PF预处理后,α-SMA表达降低(P<0.05或<0.01),E-cad表达升高(P<0.05),提示PF可缓解TGF-β1诱导HK-2细胞纤维化相关蛋白的表达,从而缓解纤维化过程,且PF高剂量组的缓解倾向更加显著。见图3。

2.4 PF对TGF-β1诱导的HK-2细胞PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响 实验进一步探讨PF对TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化发生的机制,研究其对PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平的影响。与对照组比较,模型组HK-2细胞中p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达水平升高(P<0.05);与模型组比较,不同剂量的PF对p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达的抑制效果较明显且较为接近(P<0.05或<0.01)。结果表明,PF干预能显著降低PI3K、AKT两种蛋白激酶的磷酸化水平,从而抑制PI3K/AKT信号通路的活化。见图4。

注:A:Western blot检测条带图; B:PF对p-PI3K表达的影响; C:PF对p-AKT表达的影响。与对照组比较,*:P<0.01;与模型组比较,#:P<0.05,##:P<0.01。

3 讨论

肾纤维化主要病理特征为细胞外基质在肾间质过度沉积,成纤维细胞增生,合成大量纤维,是所有慢性肾脏疾病发生和发展的病理基础,也是终末期肾衰竭的主要病理基础和重要途径[9]。当肾小管受到损伤后,在损伤部位出现淋巴细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润,分泌TGF-β1等细胞因子,在TGF-β1作用下肾间质的成纤维细胞活化转变成能表达α-SMA的肌成纤维细胞,而肌成纤维化细胞具有较强的合成细胞外基质的能力,如增加Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、纤维黏连蛋白等基质蛋白的分泌,减少E-cad的分泌[10-12]。所以,TGF-β1是目前公认的最强烈的促纤维化因子,高表达可诱导肾纤维化的发生和发展[13]。

HK-2是人肾近曲小管上皮永生细胞系,其功能完整和培养稳定,本研究选择HK-2作为细胞模型进行实验研究。CCK-8结果显示,<80 μM浓度的PF作用48 h对HK-2细胞增殖无明显影响,而160 μM PF对HK-2细胞有显著毒副作用,所以本研究选择20 μM PF作为低剂量组、80 μM PF作为高剂量组进行后续实验。

肌成纤维细胞是纤维化的主要参与者,以表达α-SMA为特征,正常肾小管上皮表达α-SMA丰度很低,肾纤维化时表达上调,这也是纤维化的重要标志[14]。E-cad是维持肾小管上皮细胞正常结构和形态的细胞黏附因子,细胞缺失E-cad后会丧失多种上皮细胞特征,发生转分化,促进肾纤维化的发生[15]。本研究结果显示,TGF-β1干预后,α-SMA表达升高,E-cad表达降低,提示TGF-β1诱导的肾纤维化细胞模型构建成功。与模型组比较,PF低剂量组、PF高剂量组α-SMA表达降低,E-cad表达升高,提示PF可改善HK-2细胞纤维化进程。

PI3K/AKT通路是细胞内重要的信号转导系统,参与多种疾病的发生、发展过程,包括调节细胞生长、分化及多种酶的活性,并能通过参与炎症途径中单核/巨噬细胞系的浸润和增生、细胞因子的表达、成纤维化细胞活化等在肾纤维化的病理过程中发挥重要作用[16]。MA等[17]研究结果表明,PI3K/AKT信号通路在单侧输尿管梗阻大鼠肾脏中磷酸化增强,YOON等[18]研究结果显示,4-羟基-TEMPD(TEMPOL)可通过PI3K/AKT信号通路减轻单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠的肾纤维化,这些研究表明,PI3K/AKT通路参与了肾纤维化的过程,PI3K的化学抑制剂LY294002已被广泛用于研究该通路在正常细胞和转分化细胞的作用[19]。本研究结果发现,与模型组比较,PF低剂量组、PF高剂量组p-PI3K和p-AKT蛋白的相对表达水平均降低,也进一步验证了PI3K/AKT信号通路在肾纤维化进程中的重要性,说明PF可通过抑制PI3K、AKT磷酸化过程减缓肾纤维化进程。

4 结论

PF干预能有效降低TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化标志物α-SMA的表达和升高E-cad的表达,同时PF能下调PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-PI3K、p-AKT的表达。PF可能通过调控PI3K/AKT信号通路抑制HK-2细胞纤维化,从而干预肾纤维化。该研究需要进一步的临床试验来验证PF对纤维化的有益作用,并需要进一步在分子水平上阐明PF的作用机制。