常用的基因检测技术在智力障碍/ 全面发育迟缓患儿中的应用进展

王 雨，刘 丽，马小萍，李洋洋，杜田菊

（1.宁夏医科大学，银川 750004；2.银川市第一人民医院，宁夏医科大学第二临床医学院，银川 750001）

智力障碍（intellectual disability，ID）/全面发育迟缓（global developmental delay，GDD）是儿童常见的神经发育障碍性疾病，包括智力及适应能力明显低于同龄儿童，常合并注意缺陷多动障碍、孤独症等疾病[1]。根据年龄将此类疾病分为两类，ID 应用于≥5 岁的儿童，GDD 用于＜5 岁的幼儿，原因可能是5 岁以下的幼儿因年龄原因不能准确地进行系统的智能及社会适应能力等量表的评估，导致误差，尤其对于轻度智力障碍的患儿，随年龄增长进行再次评估时可能不符合ID 的诊断标准[1]。据统计，ID/GDD 患病率约为1%～3%[2]。因智力受到不同程度的影响，轻者影响患儿的学习、社交等能力，重者生活不能自理，不仅给患者和家庭造成较大的影响，也给社会带来了沉重的负担，因此明确病因尤为重要。ID/GDD 的病因复杂，包括宫内感染、窒息、脑外伤、颅内感染、中毒、代谢性疾病及遗传因素等，其中遗传学病因包括染色体核型异常、染色体微缺失微重复、基因突变等[3]。目前对于诊断ID/GDD 患儿常用的基因检测方法有染色体核型分析、拷贝数变异的检测技术（CNV-Seq）、高通量测序技术（NGS）等。

1 染色体核型异常

1.1 基本概念

人类有23 对染色体，一般情况下，染色体的异常会导致大量基因的改变，因此大多数染色体异常的患儿病情较重，常伴有中、重程度的智力障碍、颜面部畸形及其他部位的畸形等。但也有例外，如罗伯逊易位，因丢失的染色体几乎由异染色质构成，不参与基因的表达，而由长臂组成的新的染色体几乎包含了两条染色体的全部表达基因，因此一般表型正常[4]。染色体核型异常通常发生在细胞水平上，包括数目和结构异常，数目异常包括染色体数目的增多和减少，结构异常主要有染色体的倒位、易位、缺失、重复等[5-6]。对于合并各种畸形、癫痫、肌张力异常、孤独症等表现的ID/GDD 患儿，称为综合征性质ID/GDD，而以单纯的智力低下为主要表现的非综合征性质ID/GDD，一般染色体核型异常因累及的基因数目较多，所以常导致综合征性质的ID/GDD[5]。

1.2 检测染色体核型异常的方法及优缺点

诊断染色体核型异常一般采用染色体核型分析技术、荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）等。目前检测染色体核型异常最为常用的方法是G 显带核型分析技术（Gbanding karyotype analysis technology），其可以在普通显微镜下清晰直观地分析每条染色体的形态特征，包括染色体的大小、结构、着丝点的位置等，而且标本易于存放，因此被广泛应用[5，7]。由于染色体核型异常累及的基因数目较多，导致临床表型复杂、多样，且大多数智力障碍程度较重，因此对于合并多器官畸形、多系统病变及智力障碍程度重的患儿，建议先行染色体核型分析检测[8]。FISH 检查针对染色体位点进行荧光探针标记，从而检测出某疾病。例如，对于临床上高度怀疑特纳（Turner）综合征时，表现为身高明显低于同龄儿童、肘外翻、蹼颈、到青春期时乳房仍呈幼稚型、智力程度不一，也可正常，超声提示性腺发育不良等临床表现时，可对X 染色体进行荧光标记，根据荧光信号点进行诊断，此方法具有耗时短、针对性强、准确率高、可以检测部分＜5 Mb的染色体微缺失微重复等优点，但其探针种类有限，只能对临床医生高度怀疑的疾病进行诊断，若合并其他染色体畸形是不能被识别出来的，同时也不能检测出染色体的多态性及平衡易位等，所以应用范围较为局限[9-10]。染色体核型分析已广泛用于确定患者ID/GDD 的原因，据统计其可明确5%～10%的遗传学病因，但由于染色体核型分析技术只能检测＞5 Mb 的染色体异常，对于＜5 Mb 的染色体微缺失微重复、基因突变等不能识别，因此导致很多阳性结果被遗漏[1，11]。

1.3 相关疾病

目前常见的染色体核型异常的疾病有21-三体综合征、5P-综合征、Turner 综合征等。其中21-三体综合征根据核型的不同分为三种类型：标准型、易位型、嵌合型，以标准型最多见，核型为47，XX，（或XY），+21，常表现为眼裂小、眼距宽、眼睛上斜，面部扁平、鼻梁低平、外耳小，常张口伸舌、流涎，头小而圆、颈部短而宽等特殊面容及中重程度的智力障碍等[6]。

2 染色体微缺失微重复

2.1 基本概念

染色体微缺失微重复是由染色体微小片段重复或缺失引发的染色体疾病，通常累及的基因改变较染色体核型异常少，对于长度＞1 kb 的DNA 片段的重复或缺失称为拷贝数变异（copy number variation，CNV），其具有较为复杂的临床表型，如智力障碍、发育迟缓、畸形等[12-13]。研究[11，14]表明，在正常健康人群中检测到的95%CNV 长度都＜100 kb ，仅有1%～2% CNVs＞1 Mb，95.4%致病性CNV 都＞500 kb，故考虑CNV 片段的大小与致病性相关。

2.2 检测CNV 常用的方法及其优缺点

针对CNV 的主要基因检测方法有：FISH、多重连接依赖探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、CNV-Seq、CMA、NGS 等。MLPA 检测较FISH 的检测通量高，其利用DNA 探针杂交和PCR 技术等，可同时对多达55 个已知的疾病位点进行检测和定量分析，具有检测速度快、准确度高、可检测已知的CNV、基因突变及基因甲基化（MS-MLPA）等优点，其检测技术较大程度地提高了ID/GDD 的诊断率，其缺点是因已知疾病位点的探针有限，因此不能检测到没有探针覆盖的区域，同时平衡易位产生DNA 顺序的变化，而不是DNA 数量的变化，所以无法检测到染色体的平衡易位、倒位等[15-17]。CMA包括基于芯片的比较基因组杂交技术（array comparative genomic hybridization，aCGH）和单核苷酸多态性微阵列（single nucleotide polymorphism array，SNP array），近年来许多基因检测平台已将两者融合在一起使用，能在全基因水平上发现大量的CNV、染色体的非整倍体、染色体重排等，具有覆盖范围广、通量高、分辨率高等优点，对于ID/GDD 患儿能够检测出15%～20%致病性CNV[18-19]。因此，该检测已被视为检测CNV 最常用的方法[12]。随着技术的发展，NGS 也可以检测大部分的致病性CNV，但由于其存在一定的假阳性率，必要时需进行拷贝数的检测进行确认[3]。CMA 技术同样具有一些缺点，如该技术不能检测染色体的倒位、平衡易位、非整倍体易位及同源染色体重复与缺失等，也无法对大部分基因突变导致的疾病做出明确诊断[2]。对于染色体片段＞5 Mb 的平衡易位、倒位，可通过染色体核型分析进行检测，但基因突变需要Sanger 测序、NGS 等进行检测。

2.3 相关疾病

常见的CNV 导致的疾病包括15q11.2-q13.1区域、7q11.23 区域、4p16.3 区域微缺失等[14]。其中15q11.2-q13.1 区域的微缺失因基因组印记的原因可导致小胖威利综合征（Prader-Willi syndrome，PWS）及天使综合征（angelman syndrome，AS）[20]。基因组印记是指对于来自同源染色体的等位基因，由于特定位点的DNA 甲基化修饰等原因，仅表达等位基因中一个亲代基因，15q11.2-q13.1 区域中包含多个与基因印记调控相关的位点，当可以表达的亲本基因缺失时，就造成了疾病的发生[20]。PWS 可有以下几种情况：此片段的缺失来自父亲（70%～75%）、母系单亲二倍体（25%～30%），印记缺陷（1%）等，其临床表型主要有不同程度的智力障碍、肌张力低下、身材矮小、性腺功能减退，婴儿早期表现为喂养困难，随后出现过度进食，进而导致过度肥胖等并发症[21]。AS 可见于以下几种情况：此片段的缺失来自母系（75%）、父系单亲二倍体（1%～2%）、印记缺陷（3%）、UBE3A基因突变（5%～10%）等，常表现为严重的智力缺陷、语言障碍、小头畸形、癫痫发作、运动的共济失调、多动、无诱因发笑、睡眠障碍等[22]。这两种疾病有多种致病机制，因此需多种检测方法才可全部覆盖，首先考虑选用覆盖范围最广的检测方法，例如甲基化特异性FISH（MSFISH），可以检测片段的缺失、单亲二倍体、印记缺陷，但不能具体区分是哪种机制引起的，所以逐渐被MS-MLPA（可以检测甲基化位点、CNV）所取代，它可以检测约99%的PWS 以及约80%的AS，具体包括的范围和MS-FISH 几乎相同；此检测可以区分片段的缺失以及印记缺陷中印记中心的缺失，对于剩余的单亲二倍体和印记缺陷中没有染色体缺失的可行微卫星分析检测（microsatellite analysis，MSA） 进行鉴别。如果MS-MLPA 检测阴性，对于PWS，几乎可排除此疾病；对于AS，如果临床表型高度怀疑，不排除UBE3A 突变引起，可行UBE3A 基因突变检测明确诊断[22]。

3 基因突变

3.1 基本概念

基因突变是指分子水平上的单个或者多个碱基的组成或顺序发生改变，从而导致疾病的发生[5]。引起单个基因突变常见的原因有小的插入与缺失（short insertion and deletion，Indel）、单核苷酸变异（single nucleotide varianiont，SNV）等[7]。

3.2 检测Indel、SNV 的常用方法及其优缺点

对于检测Indel、SNV 的主要基因检测技术有Sanger 测序、NGS 等。Sanger 测序准确度高，接近100%，不足之处是耗时、通量较低、成本高，所以临床上常用于其他基因检测结果的验证上[23]。目前临床较为常用的是NGS，它包括疾病靶向基因测序（targeted panel sequencing，TPS）、全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）和全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）[3]。TPS可以测大量已知疾病的靶向序列，因测序深度高，所以灵敏度及特异性较高，缺点是不能识别尚未被人类发现的疾病位点[3]。WES 是对编码大部分蛋白质的区域的基因组DNA 进行测序，即大部分外显子区域，其变异因影响蛋白质的表达，故对临床表型影响较大[8]。WGS 是指对人类全部基因组进行测序，相比前两者，测序深度略低、价格昂贵，主要用于完善其他基因检测后病因仍未明确的患儿[5]。目前三者中较为常用的是WES，因为WES 相对于TPS 覆盖范围更广，更有助于新致病基因的发现，相对于WGS 测序深度更高、成本更低，易于被患者家属接受，同时检测的阳性率相对较高，据统计WES 报告的ID/GDD遗传病因的诊断率为16%～45%，该技术更加适合于临床[5]。

WES 也有其缺点，其不能检测染色体大片段的异常、内含子区域、线粒体基因以及GC 高富集区、大量串联重复区，并且WES 可能出现假阳性率，需要额外的Sanger 测序验证，增加了检测的成本和时间[3，7]。随着科技的发展，WGS 从测序深度、价格方面可能会逐渐改进，不久的将来可能取代WES，成为检测ID/GDD 的常用方法。

3.3 相关疾病

目前导致ID/GDD 常见的突变基因有MECP2、FMR1、SCN1A 等。由于遗传异质性，MECP2、CDKL5、FOXG1 基因突变均可导致雷特（Rett）综合征，其中最常见的是MECP2 基因突变所致，约占典型Rett 综合征的95%～97%，由于此突变基因包含甲基化-CpG 结合结构域，故其既可通过NGS 检测，也可通过甲基化特异多重连接依赖探针扩增技术（methylation-specific MLPA，MS-MLPA）进行检测，因此，大部分的PWS、AS 也适用[24-25]。Rett 综合征好发于女性，呈X 染色体连锁显性遗传，其特征是大多数患儿，尤其是典型Rett 综合征的患儿出生后6 个月之内一般无明显的发育异常，随后出现发育倒退现象，主要表现在语言和手功能的倒退，其他症状还包括智力障碍、步态异常、手的刻板动作、异常发笑等[25]。另外，FRM1 基因改变导致的脆性X 综合征（fragile X syndrome，FXS）好发于男性，呈X 连锁不完全显性遗传，其最为常见的分子机制是由于（CGG）n 过度扩增导致启动子区CPG 岛的甲基化，在正常人群中样本量为5～44，由于动态突变的原因，在传代的过程中当其累计达到200 时引起全突变，导致FRM1 基因表观遗传沉默（此基因的组成或顺序未发生改变，但功能发生了改变），从而使生成的FMRP（FMR1 protein）减少或缺失，导致FXS 的发生；另一种是由于FRM1 基因的点突变或缺失引起，占比不足1%[26]。临床表型常表现为不同程度的智力障碍（由于女性X 染色体的随机失活，通常女性患者的智力障碍程度较轻）、面部畸形（前额突出、脸型较长、耳廓大、嘴唇厚、下颌突出等）、语言障碍、注意缺陷障碍、孤独症等[27]。目前应用的检测方法有Southern 印迹杂交结合聚合酶链反应、三引物PCR 方法等[28]。由于NGS 不能检测大量串联重复区域，因此约99%的FXS 不能通过此方法进行检测。对于临床表型高度怀疑FXS，但CGG 扩增呈阴性的患儿，不排除由不足1%的FRM1 基因的点突变或缺失的引起，可选择此方法进行检测[26]。

3.4 线粒体疾病

线粒体疾病主要是由于线粒体基因和核基因突变引起，从而影响机体的能量代谢，因线粒体在人体分布广泛且致病机制复杂，也可在少数患者中引起发育迟缓[29]。线粒体疾病是临床异质性疾病，发病年龄不一，临床表现复杂多样，儿童期发病的线粒体疾病通常比较严重，常导致全身乏力、运动耐力下降、肌张力低下、发育迟缓、癫痫等[29]。一般在成年期发病的线粒体疾病主要是线粒体基因突变引起，约占80%，儿童期发病的线粒体疾病主要是由于核基因突变引起，约占75%～80%，因此可选用包含线粒体基因的NGS明确诊断[29-30]。

ID/GDD 病因复杂、临床表型多样，具有遗传异质性，许多地区对于此类疾病的诊疗仍有欠缺。从目前诊疗指南程序来看，首先考虑是否与环境、社会文化经济有关，排除因感染、毒物、外伤、肿瘤、社交隔离等因素引起的智力障碍后，可考虑遗传因素。对于家族中具有明确的遗传病及临床表型特别符合某类疾病史的患者，可直接行相关基因检测明确诊断。目前明确遗传因素的诊断程序依次为遗传代谢病筛查、染色体核型分析、CMA 或直接行NGS，因为其既可诊断基因突变，也可诊断大部分CNV。如果以上检测技术都不能明确诊断，可行三代测序，其可实现单分子与实时测序、测序时间短、覆盖NGS 不能覆盖的区域，即GC 高富集区、大量串联重复区等，但目前三代测序尚处于发展阶段，准确度欠佳、成本高，因此主要应用于实验室当中[31]。

随着医疗技术的发展，我国由于遗传学因素导致的ID/GDD 的确诊率在逐年升高。虽然大多数ID/GDD 无法治愈，但明确病因是治疗疾病的基础，有针对性地康复训练、药物以及特殊食物等治疗方法可以在一定程度上改善预后、减轻并发症。同时，也为既往生育过ID/GDD 患儿的家庭提供精准的遗传咨询，以此减少ID/GDD 的患病率，最大限度地减轻家庭和社会的养育负担。