禽传染性支气管炎病毒疫苗的研究进展

李 阳,李 挚,邓钰蓱,马淑慧,徐 刚*

(1.天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室,天津 300392;2.中华人民共和国太原海关,山西 太原 030006)

禽传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)是一种急性、高度接触性传染病,常见于鸡,其病原为传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV),发病率高且传染性极强,主要影响产蛋鸡的生殖功能使其产蛋率及蛋品质下降,给国内外养禽行业带来巨大的经济损失[1-2]。IB在临床上主要分为3种类型:呼吸型、生殖型及肾病型,临床特征多为气管啰音、打喷嚏及咳嗽等。IB首次发现于20世纪30年代的美国北达科他州[3],20世纪70年代初在我国开始出现,并于1982年首次报道致肾病型病例[4]。在发现IBV的几十年以来,IBV毒株不断变异,血清型众多,新的血清型也不断出现。现有的商品化疫苗通常只能针对性地预防1～2种血清型,不能很好地预防其他血清型病毒的感染,而且免疫持续的时间不长,须多次接种疫苗。因此,当下的国内养禽业迫切需要一种针对大多数流行血清型免疫效果持久的IBV疫苗。现将现阶段疫苗的种类及研发情况进行归纳,并探讨现有IBV疫苗的利弊和今后研发的方向。

1 IBV

冠状病毒在分类上属于套式病毒目、冠状病毒科[5],包括α、β、γ和δ 4个属,其基因组由单股正链RNA组成,大小从27 000到32 000 bp,是最大的RNA病毒[6-7]。IBV属于γ冠状病毒属,基因约为27 000 bp,主要分为6个基因片段。基因1主要编码非结构蛋白,占基因组总长的2/3。占基因组总长1/3的基因2～6负责编码IBV的4种结构蛋白:纤突蛋白(S)、小囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和4个辅助蛋白(3a、3b、5a和5b)[8]。其中,S蛋白由3 400个核苷酸组成,翻译后在氨基末端裂解为S1亚基,在羧基末端裂解为S2亚基[9]。S1亚基蛋白在受体结合中起主要作用[10],具有免疫原性,包含中和抗体的多种表位[11-12]。E蛋白是最小的结构蛋白[13-14],具有离子通道活性[13],主要协同M蛋白参与IBV增殖过程中的病毒出芽、装配与释放[15-17]。M蛋白在病毒蛋白中占比较大,主要负责病毒的装配与成熟[18]。N蛋白为40～50 kDa,其主要作用是与病毒RNA结合形成保护基因组结构—核衣壳结构[19-20]。辅助蛋白3a、3b、5a和5b的具体功能未知,可能有增加病毒毒力的作用[21-22],但与病毒复制关系甚微[23]。

2 IB常规疫苗

2.1 减毒活疫苗IB减毒活疫苗的制备方法是将IBV毒株接种于鸡胚内并连续传代将其致弱,免疫原性保留程度较好。但是,免疫效果持续时间比较短,需要在接种2～3周后使用相同或其他毒株的组合再次进行强化接种才可以达到良好的免疫效果[24]。目前,Mass型的H120和H52株是世界上使用最广泛的减毒活疫苗毒株。但在国内,QX与TW型是目前较为流行的基因型[25],且都与经典的Mass型疫苗株在基因型和血清型上存在较大差异,导致禽类免疫Mass型疫苗株后仍频频发病。

近年来,许多研究也发现了针对QX和TW型IBV流行株的疫苗候选株。通过传代减毒致弱选择的第90代YX10p90毒株[26]、连续传代130代得到的SZ130株[27]、IBV QX型弱毒YN(aYN)株[28]、将QX型IBV QXL毒株连续传87代致弱得到的QXL87株[29]等都是目前针对性预防QX型毒株的良好的疫苗候选株。目前,国内上市的唯一的QX型疫苗——鸡新城疫、鸡传染性支气管炎(LaSota株+QXL87株)二联活疫苗中使用的就是QXL87株,免疫效果良好[30]。其次,XU等[31]发现,经过140次传代的TW型减毒株aGD株安全性高,对SPF鸡无明显致病性,免疫后保护TW和QX型毒株的侵害,可以作为预防TW和QX型毒株的疫苗候选。

减毒活疫苗的制备过程简单、成本较低、使用方便,仅需喷雾免疫或饮水免疫就可以群体免疫,并在禽类体内同时产生细胞免疫和体液免疫[32]。但是,减毒活疫苗的研制耗时长,安全性较差,虽已经过传代致弱,但仍然有一定的致病能力,有可能在鸡群内造成IB的传播。另外,减毒苗还存在毒力返强或是毒力不稳定的问题,同时使用多种减毒苗时,还可能造成减毒苗间或减毒苗和野毒株间重组变异产生新血清型[33-35]。

2.2 灭活疫苗灭活疫苗是指病毒通过物理或化学方法灭活使抗原失去致病性保留抗原性的疫苗。灭活苗安全性好,不会返毒,早在1977年COUGH等[32]就首次使用油乳剂IB灭活疫苗,王红宁等[36]之后也研制出了IB多价油乳剂灭活疫苗。近几年来,灭活苗通常与禽流感、鸡新城疫、传染性法氏囊病等病组成多联疫苗,洪素梅等[37]试验表明鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活苗(LaSota株+M41株+Re-9株)[三联苗(Re-9株)]投入应用后免疫效果良好。另外,从多年多个省市中筛选出的QX型IBV JS-96株制成的油乳剂灭活苗对QX型IBV的保护效果良好[38],此株可作为IBV多价灭活苗的候选毒株。

但是,灭活苗的缺点也十分明显:灭活苗诱导的免疫反应很短,因此需要多次接种免疫,同时需要注射其他减毒活疫苗或者大剂量佐剂,成本较高,应用较为困难[39];而且改变注射部位也会影响其免疫效果,甚至可能产生排斥反应[40];灭活苗一般仅针对地方化流行的IBV免疫效果较好。因此,IBV灭活苗对于地方流行株应用范围更广,不宜商品化,无法在全国内大规模生产使用。

3 基因工程疫苗

3.1 亚单位疫苗亚单位疫苗是指利用基因工程的方法构建,在高效表达系统中表达强毒病原体的某种免疫相关抗原[41],提取抗原后制成的疫苗,安全性高、无毒、生产成本低、经济效益高。IB基因工程亚单位疫苗的表达系统主要包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和昆虫细胞表达系统等[32]。IBV的主要免疫原基因为纤突蛋白S基因。据报道,全长S1基因重组蛋白免疫小鼠可以产生IBV特异性中和抗体[41]。苏艳静等[42]也利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了IBV GX-YL5毒株的S1蛋白,调整蛋白浓度后对成年新西兰大白兔进行免疫,结果试验动物的特异性免疫良好,S1蛋白的免疫原性足以作为亚单位疫苗的首选靶蛋白。另据报道,植物系统经试验也可以有效表达IBV S基因——从根瘤菌提取的全长S基因转入马铃薯并进行表达,用获得的免疫原免疫雏鸡且在体内发现抗体[43]。

S蛋白是IBV主要的免疫原蛋白,但研究发现N蛋白上也存在一定量抗原决定簇[44],其蛋白抗原指数比S蛋白要高[45],N蛋白上的线性B细胞抗原也被证实[46],因此N蛋白同样也可以作为制作IBV亚单位疫苗的有效抗原,这为IBV亚单位疫苗的研发提供了一种新思路。但是,亚单位疫苗相对于其他类型的疫苗来说免疫原性较差,免疫效果较差,在制作时需要添加大量有活性的佐剂,并不能像活疫苗一样在一定范围内广泛使用。

3.2 重组病毒活载体疫苗重组病毒活载体疫苗是利用分子生物学遗传工程技术,将某一病原的保护性抗原基因整合到目的病毒的非必需基因片段,使该保护性抗原基因表达,一般以痘病毒或腺病毒作为载体。痘病毒是最早作为病毒疫苗载体的病毒,在兽医领域第一次使用是在1982年牛痘病毒作为载体表达外源基因[47]。痘病毒在IBV疫苗中首次被使用是BINNS等[48]利用其作为载体表达S1蛋白研制出的IBV基因工程疫苗,安全性强,在体内复制无害,可以激发机体较强的免疫应答。虽然痘病毒活载体疫苗具有高效、成本低、免疫持久等优点,但经试验对比发现,痘病毒疫苗和减毒疫苗的免疫效果相当,而痘病毒疫苗组的抗体水平低于减毒疫苗组[49],因此痘病毒载体疫苗仍然有优化改进的空间。将腺病毒作为重组病毒疫苗的载体时,腺病毒会导致淋巴组织的持续性感染[41-50],显示以腺病毒为载体的重组疫苗安全性较差,适用范围受到限制。

3.3 重组细菌活载体疫苗重组细菌活载体疫苗作为一种新型疫苗,和病毒活载体疫苗同是活载体疫苗的主要种类。细菌活载体疫苗主要以减毒沙门菌和分枝杆菌为主。由于细菌的培养方便,耗时短,易扩增,经改造后的细菌毒力低,可以一同运输多抗原和增强免疫的基因的真核表达质粒[41]。王芳等[51]将构建的重组减毒鼠伤寒沙门菌接种小鼠,观察1个月后未发现小鼠有异常现象,解剖后脏器也未见异常,且仍能从小鼠体内分离到细菌,这标志着此疫苗能够使机体产生足够的免疫保护。此外,以减毒鼠伤寒沙门菌为载体表达IBV S1基因的重组疫苗防御效果与减毒苗和灭活苗相当[52],以分枝杆菌为载体的IBV重组疫苗同样具有良好的免疫效果,可以保护SPF鸡免受同血清型强毒株的攻击[53]。虽然以细菌为载体的重组疫苗具有较好的免疫效果,递呈抗原及基因能力良好,但是其安全性争议较大,一些减毒的重组疫苗进入机体免疫后仍会毒力返强并产生损伤。另外,重组细菌活载体疫苗在机体免疫时会在一定程度上出现免疫原耐受的现象,导致其免疫效力大幅下降,并不能在禽类养殖业广泛使用。

3.4 核酸疫苗核酸疫苗又称基因疫苗,指将含有编码的免疫源性蛋白质基因序列注入特定的宿主细胞内,其通过宿主细胞表达抗原蛋白并使宿主细胞产生相对应的免疫应答,主要分为DNA疫苗和RNA疫苗2种,目前主要以研究DNA疫苗为主。与传统减毒苗、灭活苗相比,核酸疫苗无需载体,通过特定途径激活免疫机制,可以大大降低因载体转化造成免疫效力下降的风险[54]。在我国,步志高等[55]最早构建了IBV的DNA免疫质粒,证明了其可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。在国外也很早开发出一种名为pDKArkS1-DP的DNA疫苗,接种后免疫效果显著,受强毒株攻击后保护率也能达到80%左右[56]。ZUO等[57]利用新设计的免疫原开发了DNA疫苗pV-Scon,接种后可诱导细胞和体液免疫,病毒脱落明显减少,对于像IBV此类高变异性的病毒DNA疫苗有效可行。另外,S1编码的DNA疫苗比N基因编码的DNA疫苗的免疫效果强,在机体受到病毒攻击后提供主要保护,基于此还开发了一种编码S1、N和M蛋白的IBV的多价DNA疫苗[58-59]。但是,DNA疫苗大部分都通过肌肉注射进行免疫,这就限制了DNA疫苗在禽类当中的应用[60]。

4 新型佐剂在IB疫苗的应用

疫苗佐剂也称抗原佐剂,本身不具有抗原性,是一类能够增强抗原免疫原性的物质。加入了佐剂的疫苗能在很大程度上增强疫苗本身的免疫原性,使免疫效果达到预计效果。常用的疫苗佐剂包括铝盐佐剂、油乳佐剂、天然佐剂、细胞因子佐剂、脂质体佐剂、纳米佐剂、Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)、皂苷佐剂、聚合物佐剂等。目前,我国兽用的新型佐剂疫苗主要是使用纳米佐剂的疫苗。

纳米佐剂是指用聚合物等纳米粒子材料制成的佐剂[61],其优势在于纳米粒子独有的物理特性可以使其穿过组织间隙或毛细血管,包裹抗原后表现出较高的稳定性,溶解性强,被机体吸收后可诱导机体产生强烈的特异性免疫反应。LOPES等[62]通过离子凝胶法制备了一种含有BR-I基因型毒株的IB灭活疫苗,该疫苗用壳聚糖纳米颗粒包裹,接种纳米颗粒包裹的疫苗组相对于其他组在气管和肾脏等主要部位会产生更强烈的体液和细胞免疫反应。此外,CHANDRASEKAR等[63]通过试验开发了一种新型纳米佐剂系统,此佐剂系统不仅能使疫苗免疫原性增强,还能将病毒抗原分解为供抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)摄取的最佳直径,促进APC对抗原的吸收与加工。纳米佐剂疫苗发展潜力巨大,但是近年来纳米佐剂技术的发展并不成熟,纳米佐剂的材料选取以及纳米技术是研发新型纳米佐剂疫苗仍要攻克的难关。

5 反向遗传技术在IB疫苗的应用

反向遗传操作技术是近年来新兴的一种以遗传学为基础通过改变遗传物质或基因型从而深入研究病毒致病基因的技术。利用反向遗传操作技术定点改造流行毒株毒力基因制成的疫苗称为反向遗传基因疫苗。脊髓灰质炎病毒是最早利用该技术拯救出来的RNA病毒[64]。由于冠状病毒基因组较大,普通的质粒无法作为载体,而且其原生毒性较强,其反向遗传操作系统的构建一直难以成功,首次成功是20世纪初ALMZAN等[65]利用细菌人工染色体技术成功构建的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的反向遗传操作系统。之后,CASAIS等[66]利用痘苗病毒为载体成功拯救出IBV Beaudette株,该株无毒力,可在细胞中繁殖。近年来,周生等[67]、JIANG等[68]利用反向遗传操作技术以IBV H120株为骨架分别替换流行株IBYZ、ck/CH/IBYZ/2011的S基因,构建的重组株制作的疫苗免疫后效果良好,安全性较高。

利用反向遗传技术制作出的疫苗为活疫苗,不仅具有与活疫苗相同的良好的免疫原性和安全性,在机体内也能够诱导较好的免疫反应。该技术可以人为地改变流行毒株的毒力基因并较快地致弱毒株,在大规模制作疫苗时可以省去传统致弱活疫苗冗长的步骤以及其他新型疫苗繁琐的程序,降低生产成本,在一定程度上解决IBV血清型众多而没有针对性疫苗引发的问题。

近几年国内对于IB疫苗的研究大多都集中于天然无毒力的IBV Beaudette株,虽然此毒株可以在细胞中繁殖,便于研究,但是它对禽类并无致病性,那么基于此株研究出的疫苗在实际生产生活中是没有实际意义的。如果能将反向遗传操作技术利用在我国现有的流行株上,针对性地寻找并改造流行株的关键致弱位点或基因,就能在IBV新的血清型出现时快速地研发出疫苗,降低养殖户成本损失,造福行业。

6 小结与展望

IB是危害禽类养殖业的主要传染病,接种IB疫苗仍然是当前我国预防和控制IB最有效的手段,主要以减毒活疫苗与灭活苗等常规疫苗使用较为普遍。基于IB病原的研究和当代分子生物学基础的基因工程疫苗在安全性、免疫效果、持久性等方面都有了提升,新型佐剂疫苗的研究也为IB的预防提供了新思路。但是,IB疫苗的开发和使用仍然面临着一些问题:IBV基因突变率高,血清型种类众多,一些新血清型仍在暴发式地出现,不同血清型的毒株之间交叉保护程度较小甚至没有;疫苗的贮存、运输、接种方式与饲养管理也同时影响着免疫效果。

目前,传统疫苗仍是最经济有效的疫苗,尤其是减毒活疫苗,但是与其他类型的疫苗相比,其最大的缺点就是时效性太差。制备针对流行毒株的减毒活疫苗时,常规传代致弱通常需要1年以上的时间。如此耗时对于及时研发针对流行毒株的疫苗工作存在较大弊端,因此,有必要寻找更为稳定而且便捷的方法及时获得可防控流行毒株的减毒活疫苗。近年来,利用反向遗传技术针对IBV传代后毒力减弱的机制研究发现,单独突变S基因或复制酶基因1ab上的关键区域,可导致病毒毒力显著减弱,说明S基因或复制酶基因1ab是影响IBV毒力或致病性的关键[31,69-70]。如果能进一步探究这些关键区域位点的普遍性,确定影响IBV毒力的决定性氨基酸位点,就可以利用反向遗传技术,快速精准的改造流行毒株的毒力决定位点,实现对流行毒株的快速致弱,可以更有效、更快捷地研发出更实用、高效、安全的新型IBV疫苗,减少传统疫苗给养殖业带来的不便与危害。