苗药三两银非生物碱成分的分离鉴定

黄颖雪 简 洁 徐贵萍 吴继春

贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025

野扇花(SarcococcaruscifoliaStapf.)隶属于黄杨科野扇花属[1]，为贵州苗族民间习用草药，全株入药，民间称为三两银、胃友，收录于2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》，具有行气活血、祛风止痛等功效，用于治疗胃脘疼痛、风寒湿痹、跌扑损伤等[2]。南亚地区各国民间也用该属植物治疗腹泻、疟疾、风湿和肌肉疼痛等疾病[3]。对野扇花属植物的化学成分和活性研究始于上世纪60年代，主要集中于其中的生物碱类成分，从中发现一百余个孕甾烷型生物碱[3-5]，但是对非生物碱类成分的研究较少。本课题组在野扇花生物碱的分离过程中，发现总生物碱浸膏中存在非生物碱。对非生物碱的分离得到6个化合物，包括1个长链烯烃和5个三萜，报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Bruker Avance Neo-400 MHz核磁共振波谱仪(TMS为内标，德国Bruker公司)；Buchi旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；WFH-308B型三色紫外分析仪(上海精科实业有限公司)；超声仪(上海科导超声仪器有限公司)；数显热风枪(德力西电气)。

1.2 材料 柱层析硅胶(200～300目，青岛海洋化工有限公司)；柱层析碱性氧化铝(200～300目，国药集团)；氨基硅胶(40～75 μm，日本Fuji公司)；GF254薄层硅胶板(青岛海洋化工有限公司)。其它试剂分析纯。

三两银药材2015年7月采于贵州省贵阳市观山湖区，由贵州中医药大学江洪副教授鉴定为野扇花(SarcococcaruscifoliaStapf.)枝干。标本存放于贵州省苗医药重点实验室(标本号201507001)。

2 提取与分离

干燥的野扇花枝干10 kg，粉碎，浸泡于25 L甲醇中，超声提取5次，每次30 min。提取液减压浓缩得浸膏。浸膏加0.5 mol/L H2SO4溶液调pH至2。酸水液(2.0 L)用等体积乙酸乙酯萃取5次，除去溶脂性非生物碱，然后加饱和Na2CO3溶液调pH至9。碱水液(2.7 L)加等体积二氯甲烷萃取3次，得总生物碱105 g。总生物碱经碱性氧化铝柱层析分离，石油醚∶乙酸乙酯 (100∶0→0∶100)梯度洗脱，分为Fr.A～Fr.Q共16部分。Fr.A经硅胶柱层析分离，石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺 (20∶1∶1)洗脱，得到化合物1 (76 mg)。Fr.B经氨基硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯 (100∶0→0∶100)梯度洗脱，分为Fr.B-1～Fr.B-6。Fr.B-1和Fr.B-5分别经硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺 (20∶1∶1)洗脱，得到化合物2 (40 mg)、3 (11 mg)。Fr.C经氨基硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯 (100∶0→0∶100)梯度洗脱，分为Fr.C-1～Fr.C-7。Fr.C-6再经硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺 (20∶1∶1)洗脱，得到化合物4 (40 mg)、5 (16 mg)。Fr.I经氨基硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯 (100∶0→0∶100)梯度洗脱，分为Fr.I-1～Fr.I-13。Fr.I-5再经硅胶柱层析，石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺 (10∶1∶1)洗脱，最后重结晶(乙酸乙酯)得到化合物6 (190 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：无色油状，易溶于石油醚，分子式C32H64。薄层层析后10%硫酸-乙醇显色剂加热显红色。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.83 (1H，ddt，J=17.0，10.2，6.7 Hz，H-2)，5.08～4.90 (2H，m，H-1)，2.06～1.94 (2H，m，H-3)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：139.2 (C-2)，114.1 (C-1)，33.9 (C-3)，32.0 (C-30)，29.8～29.1 (C-4～C-29)，22.8 (C-31)，14.2 (C-32).以上数据与文献[6]报道一致，故鉴定化合物1为dotriacont-1-ene。

化合物2：无色油状，易溶于石油醚，分子式C46H82O3。薄层层析后10%硫酸-乙醇显色剂加热显紫红色。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.11 (1H，t，J= 7.0 Hz，H-24)，4.48 (1H，dd，J=10.5，5.8 Hz，H-3)，2.28 (2H，t，J=7.5 Hz，H-1′)，1.69，1.62，1.14，0.96，0.88，0.87，0.85，0.85，(each 3H，s，H-18，19，21，26～30)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：173.7 (C-1′)，131.5 (C-25)，124.7 (C-24)，80.6 (C-3)，75.4 (C-20)，56.0 (C-5)，50.7 (C-9)，50.3 (C-14)，49.8 (C-17)，42.3 (C-13)，40.6 (C-22)，40.4 (C-8)，38.7 (C-4)，37.9 (C-1)，37.1 (C-10)，35.2 (C-7)，34.9 (C-2′)，31.9 (C-14′)，31.2 (C-15)，29.7 (C-4′)，29.7 (C-5′)，29.7 (C-6′)，29.7 (C-7′)，29.6 (C-8′)，29.6 (C-13′)，29.5 (C-9′)，29.4 (C-10′)，29.3 (C-11′)，29.2 (C-12′)，24.8 (C-3′)，28.0 (C-28)，27.5 (C-16)，25.7 (C-26)，25.4 (C-12)，25.2 (C-21)，23.7 (C-2)，22.7 (C-23)，22.6 (C-11)，21.6 (C-15′)，18.2 (C-6)，17.7 (C-27)，16.6 (C-18)，16.4 (C-30)，16.3 (C-19)，15.5 (C-29)，14.1 (C-16′)。以上数据与文献[7]报道一致，故鉴定化合物2为达玛烯二醇3-O-棕榈酸酯。

化合物3：无色油状，易溶于石油醚，分子式C46H82O4。薄层层析后10%硫酸-乙醇显色剂加热显紫红色。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：4.47 (1H，dd，J= 10.6，5.7 Hz，H-3)，3.72 (1H，t，J=7.2 Hz，H-24)，2.28 (2H，t，J=7.5 Hz，H-2′)，1.48 (3H，m，H-16′)，1.20 (3H，s，H-27)，1.12 (3H，s，H-21)，1.11 (3H，s，H-26)，0.95(3H，s，H-18)，0.87(3H，s，H-28)，0.86 (3H，s，H-30)，0.84 (6H，s，H-19，29)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：173.7 (C-1′)，86.4 (C-20)，86.3 (C-24)，80.6 (C-3)，70.2 (C-25)，56.0 (C-5)，50.7 (C-9)，50.0 (C-14)，49.6 (C-17)，43.0 (C-13)，40.4 (C-8)，38.7 (C-1)，37.9 (C-4)，37.1 (C-10)，35.7 (C-7)，34.9 (C-22)，34.9 (C-2′)，31.9 (C-14′)，31.5 (C-15)，29.7 (C-4′)，29.7 (C-5′)，29.7 (C-6′)，29.7 (C-7′)，29.6 (C-13′)，29.6 (C-8′)，29.5 (C-9′)，29.4 (C-10′)，29.3 (C-11′)，29.2 (C-12′)，28.0 (C-29)，27.8 (C-27)，27.0 (C-26)，27.3 (C-12)，26.4 (C-23)，25.7 (C-16)，25.2 (C-3′)，24.0 (C-21)，23.8 (C-2)，22.7 (C-11)，21.6 (C-15′)，18.2 (C-6)，16.6 (C-30)，16.4 (C-19)，16.3 (C-28)，15.5 (C-18)，14.1 (C-16′)。以上数据与文献[8]报道一致，故鉴定化合物3为20，25-epoxydammarane-3β，24α-diol-3-O-palmitate。

化合物4：白色针晶(乙酸乙酯)，分子式C30H50O。薄层层析后10%硫酸-乙醇显色剂加热显紫红色。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：4.69 (1H，d，J=2.5 Hz，H-29a)，4.56 (1H，dd，J= 2.6，1.4 Hz，H-29b)，3.17 (1H，d，J=5.0 Hz，H-3)，2.38 (1H，td，J=11.0，5.8 Hz，H-19)，1.68，1.03，0.97，0.83，0.79，0.76(each 3H，s，H-23～28，30)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：150.9 (C-20)，109.4 (C-29)，79.0 (C-3)，55.3 (C-5)，50.4 (C-9)，48.3 (C-19)，48.0 (C-18)，43.0 (C-17)，42.8 (C-14)，40.8 (C-8)，40.0 (C-22)，38.9 (C-4)，38.7 (C-1)，38.1 (C-13)，37.2 (C-10)，35.6 (C-16)，34.3 (C-7)，29.9 (C-21)，28.1 (C-23)，27.5 (C-2)，27.4 (C-15)，25.1 (C-12)，20.9 (C-11)，19.3 (C-30)，18.3 (C-6)，18.0 (C-28)，16.1 (C-25)，16.0 (C-26)，15.4 (C-24)，14.6 (C-27)。以上数据与文献[9]报道一致，故鉴定化合物4为羽扇豆醇。

化合物5：白色针晶(乙酸乙酯)，分子式C30H50O。薄层层析后10%硫酸-乙醇显色剂加热显紫红色。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.18 (1H，t，J= 3.7 Hz，H-12)，3.20 (1H，dd，J= 5.1，3.1 Hz，H-3)，1.13，1.00，0.97，0.94，0.87，0.83，0.79，0.79 (each 3H，s，H-23～30)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：145.2 (C-13)，121.7 (C-12)，79.0 (C-3)，55.2 (C-5)，47.6 (C-9)，47.2 (C-18)，46.8 (C-19)，41.7 (C-14)，39.8 (C-8)，38.8 (C-1)，38.6 (C-4)，37.2 (C-22)，37.0 (C-10)，34.7 (C-21)，33.4 (C-29)，32.7 (C-7)，32.5 (C-17)，31.1 (C-20)，28.4 (C-28)，28.1 (C-23)，27.2 (C-2)，27.0 (C-16)，26.2 (C-15)，26.0 (C-27)，23.7 (C-30)，23.5 (C-11)，18.4 (C-6)，16.8 (C-26)，15.6 (C-24)，15.5 (C-25)。以上数据与文献[6]报道一致，故鉴定化合物5为β-香树脂醇。

化合物6：白色羽状结晶(乙酸乙酯)，分子式C30H50O2。薄层层析后10%硫酸-乙醇显色剂加热显紫红色。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.60 (2H，overlaped，H-23，24)，5.26 (1H，d，J=3.5 Hz，H-7)，3.24 (1H，dd，J=11.2，4.4 Hz，H-3)，1.96 (2H，m，H-6)，1.31，1.31，0.96，0.96，0.86，0.83，0.81，0.74 (each 3H，H-18，19，21，26～30)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：145.8 (C-8)，139.4 (C-24)，125.6 (C-23)，117.9 (C-7)，79.2 (C-3)，70.7 (C-25)，52.6 (C-17)，51.1 (C-14)，50.6 (C-5)，48.9 (C-9)，43.5 (C-13)，38.9 (C-4)，38.8 (C-22)，37.2 (C-1)，36.5 (C-20)，34.9 (C-10)，34.0 (C-15)，33.6 (C-12)，30.0 (C-26)，29.9 (C-27)，28.1 (C-16)，27.7 (C-2)，27.6 (C-28)，27.2 (C-30)，23.9 (C-6)，21.9 (C-18)，18.4 (C-21)，18.1 (C-11)，14.7 (C-29)，13.1 (C-19)。以上数据与文献[10]报道一致，故鉴定化合物6为(23E)-euph-7，23-dien-3β，25-diol。

4 结果与讨论

通过氧化铝、氨基硅胶和硅胶柱层析，从苗药三两银总生物碱浸膏中分离得到6个脂溶性非生物碱，包括1个长链烯烃和5个三萜，分别鉴定为三十二碳-1-烯 (1)、达玛烯二醇3-O-棕榈酸酯(2)、20，25-epoxydammarane-3β，24α-diol-3-O-palmitate (3)、羽扇豆醇 (4)、β-香树脂醇 (5)、(23E)-euph-7，23-dien-3β，25-diol (6)，均为首次从该属植物中分离得到。其中，化合物2、3、6为达玛烷型四环三萜。查阅文献发现，化合物2的母体达玛烯二醇是合成达玛烷型人参皂苷的关键中间体[11]，具有降血脂活性[12]；化合物3对粘性放线菌有弱的抗菌活性[8]；化合物6对糖尿病靶点α-葡萄糖苷酶具有体外抑制活性[13]。化合物4是一种广泛存在于多种植物中的羽扇豆烷型五环三萜，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用[14]。化合物5是一种分布广泛的齐墩果烷型五环三萜，具有抗炎、抗菌、抗病毒及降血糖、降血脂等活性[15]。野扇花中存在结构多样的三萜类成分，值得深入研究。

根据天然产物化学性能[16-17]，本实验中的非生物碱应该存在于从酸水液中萃取的乙酸乙酯部分，碱化后从碱水液中萃取的二氯甲烷部分不应该有非生物碱。总生物碱中存在三萜等非生物碱的原因可能是用乙酸乙酯从酸水液中萃取非生物碱的时候萃取不完全，也可能是酸水液中存在的生物碱增加了非生物碱在酸水中的溶解度。非生物碱的存在增加了后续生物碱分离纯化的难度，也降低了总生物碱活性实验结果的可靠性。今后有必要继续研究提高和检测总生物碱纯度的简单方法。

实验中，首先采用碱性氧化铝为吸附填料、不含碱性试剂(如二乙胺)的溶液为洗脱剂，接着采用氨基硅胶为吸附填料、同样用不含碱性试剂的溶液为洗脱剂，最后采用硅胶为吸附填料，用含有碱性试剂的溶液为洗脱剂，可以高效地分离纯化脂溶性生物碱和非生物碱。