长链非编码RNA-LINC00467调控代谢重编程对肺腺癌增殖及迁移的影响

张 萌,奚欣然,李泳华,汪向海

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 呼吸内科,安徽 芜湖 241001)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要病理类型,肺腺癌(lung adenocarcinoma,LAD)占NSCLC的大部分。近年来肺癌的诊断和治疗取得了重大进展[1],但LAD患者的生存堪忧,只有约15%的患者在诊断后存活5年[2]。因此,迫切需要寻找新的生物标志物和治疗策略来改善LAD的治疗。

研究表明,长链非编码RNA00467(long intergenic non-coding RNA00467,LINC00467)与许多临床特征有关,并已被探索为致癌性。LINC00467通过肺癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、骨肉瘤等不同癌的多种分子和信号通路促进肿瘤的发展和进展[3-7]。LINC00467也被认为是疾病诊断、预后和治疗中的潜在生物标志物。

癌细胞在肿瘤生长微环境中需要获得与正常细胞不同的代谢状态,才能增殖、侵袭和转移。在癌细胞生长过程中,癌细胞会遇到各种代谢应激,癌细胞会根据各种代谢应激改变自己的微环境状态。首先,与原发部位的非肿瘤组织相比,肿瘤细胞所生长的微环境通常是缺氧和酸性的,并且具有独特的营养成分,这样,癌细胞才能在微环境中更好地生长入侵。其次,为了更快进入血管,在血管中得以存活和生长,癌细胞必须重新编程其代谢状态,改变其能量代谢水平,允许锚定性生长,从而在癌细胞中诱导广泛的氧化应激。最后,一旦癌细胞定植于其他器官,它们必须让自己适应与原发部位不同的代谢微环境,这样才能更快增殖迁移[8]。由于癌细胞在癌症进展中都需要重新编程其代谢状态,因此代谢重编程已被公认为癌症的标志之一。本研究对LINC00467影响调控能量代谢的现象进行描述,发掘代谢重编程在临床治疗中的潜在价值。

1 材料和方法

1.1 材料 肺癌细胞系(A549和H1299)和正常人支气管上皮细胞系(16HBE)均由东部战区总医院呼吸内科实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 肺癌细胞A549和H1299在含有10%胎牛血清(Gibco,USA)的RPMI-1640(Gibco,USA)中于37℃和5%CO2的培养箱中培养。设计并合成敲降LINC00467的慢病毒shRNA(shRNA-LINC00467)。根据汉恒生物转染试剂(HANBIO)的说明书,在大约60%的汇合处用shRNA转染细胞。

1.2.2 实时定量PCR(qRT-PCR) 取Trizol 500 μL加入6孔板中反复吹打混匀,吸入1.5 mL离心管中,加入200 μL的三氯甲烷,离心,取上清加入500 μL异丙醇,颠倒混匀再次离心,倒掉上液保留沉淀,加入乙醇再次离心,弃去上清,加入DEPC水20 μL。在cDNA合成试剂盒进行逆转录转录成cDNA。qRT-PCR用QuantiNovaTMSYBR®Green PCR Kit(Qiagen,Hilden,Germany)进行上机检测。LINC00467的引物,正向(5′-3′):GCGTAGGCCGGACATTTCTA;反向(5′-3′):CACCAAGGTTCAGCAGATCCGC。用△△ct法计算LINC00467表达的差异。

1.2.3 Western blot 收集6孔板中的细胞在裂解缓冲液中裂解15～30 min,使用细胞刮把细胞刮下来,收集于1.5 mL离心管中,离心后取上清,用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度,加入上样缓冲液,混合完全后封口煮沸10 min。蛋白质样品用SDS-PAGE电泳分离,蛋白质转移到NC膜上。在室温下用5%BSA将膜封闭2 h,然后在4℃下用稀释的一抗孵育过夜。洗膜3次,每次10 min,之后在室温下使用二抗孵育2 h。再次洗膜3次,每次10 min。用ECL溶液曝光观察印迹。

1.2.4 平板克隆实验 使用细胞计数仪按1 000个/孔进行细胞计数,将转染处理后的癌细胞培养在6孔板中,然后加入新培养基,培养2周。4%多聚甲醛室温固定细胞30 min。PBS清洗3次,结晶紫染色30 min,PBS清洗3次。结果用ImageJ软件进行分析。

1.2.5 Transwell实验 在24孔板的孔中放置Transwell小室,在上室中接种2×104个体积为200 μL的细胞,在下室中加入600 μL RPIM 1640培养基(含10%FBS)。孵育24 h后,用PBS冲洗1遍,4%多聚甲醛固定30 min,结晶紫溶液染色30 min,用PBS缓冲液冲洗后,用棉签轻轻拭去水分,进行拍照。

1.2.6 流式细胞术 使用细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。转染48 h后收集细胞,冷PBS清洗细胞2遍,400 μL 1× Annexin V结合液重悬细胞,加入5 μL Annexin V-FITC轻轻混匀后于2～8℃避光下孵育15 min,加入5 μL PI混匀后2～8℃避光孵育2～5 min(每个细胞系都设有FITC单染、PI单染和空白对照来调试画门)。立即用流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.7 乳酸含量检测 收集细胞,向细胞中加入提取液1,冰浴超声机破碎细胞后12 000 r/min离心10 min,取上清,加入提取液2,再次离心取上清,按照加样表格分别按量加样,并在570 nm处测定吸光度,LA含量根据公式计算。

1.2.8 ATP水平检测 弃去原培养液,按照每孔200 μL的ATP裂解液加入裂解细胞,反复吹打,裂解后4℃ 12 000 r/min离心5 min取上清,用ATP检测裂解液将ATP标准溶液稀释至浓度:0.1、1、10 μmol/L,在黑色96孔板中加入100 μL ATP检测工作液,室温放置5 min,在黑色96孔板中加入20 μL样品及标准品,混匀,用多功能化学发光酶标仪测定RUL值,根据标准曲线计算样品中的ATP含量,样品用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,将ATP结果换算成nmol/mg蛋白形式。

2 结果

2.1 LINC00467在LAD中的表达较高 本研究在TCGA和GTEX数据库中分析了LAD和癌旁组织中的表达,与正常癌旁组织相比,LAD组织中LINC00467表达水平较高(t=35.516,P<0.001)(图1A)。qRT-PCR结果表明,LAD细胞株A549和H1299中LINC00467的表达均高于人支气管上皮肺泡细胞株16HBE(P<0.01)(图1B)。

A.正常组织和LAD组织中LINC00467的表达水平;B.LINC00467在不同细胞系中的表达水平(F=714.100,P<0.001),与16HBE组比较,**P<0.01,***P<0.001。

2.2 敲降LINC00467可以抑制LAD细胞的增殖和迁移 shRNA慢病毒稳定转染LAD细胞系,通过荧光显微镜和qRT-PCR验证shRNA的敲降效率(t=8.362、6.919,P<0.001)(图2A、B)。平板克隆实验表明,敲降LINC00467表达后H1299和A549细胞增殖活力降低(t=3.606、4.625,P<0.05)(图2C、D)。Transwell实验显示敲降LINC00467表达,H1299和A549细胞迁移能力降低(t=7.411、5.935,P<0.01)(图2E、F)。流式细胞术检测结果表明,敲降LINC00467组的H1299和A549的凋亡细胞增多(t=7.814、7.078,P<0.01)(图2G、H)。

A.慢病毒转染后的荧光图;B.qRT-PCR验证LINC00467的敲降效率;C.平板克隆图;D.平板克隆统计分析;E.Transwell小室图;F.小室统计分析;G.流式细胞凋亡图;H.流式凋亡分析。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.3 敲降LINC00467可以抑制代谢相关蛋白己糖激酶2(Hexokinase2,HK2)和葡萄糖转运体1(Glucose transporter1,GLUT1)的表达 Western blot结果显示,与对照组相比,敲降LINC00467组可以抑制GLUT1和HK2的表达水平(t=19.510、26.940、10.160、13.950,P<0.001)(图3)。

A.GLUT1和HK2的蛋白电泳图;B.GLUT1和HK2的蛋白表达水平。***P<0.001。

2.4 敲降LINC00467可以明显降低乳酸含量和ATP水平 ATP检测试剂盒和乳酸含量检测试剂盒检测结果显示,敲降LINC00467组的H1299和A549细胞的乳酸含量降低(t=11.540、6.805,P<0.001)(图4A)和ATP含量降低(t=6.418、5.994,P<0.001)(图4B)。

A.敲降LINC00467后的乳酸水平;B.敲降LINC00467后的ATP水平。***P<0.001。

3 讨论

长链非编码RNA参与RNA稳定性、剪切加工、表观遗传调节和基因转录,在细胞生物学过程中发挥重要作用。LINC00467具有4个转录本,全长3 508 bp,属于基因间长链非编码RNA[9]。研究发现LINC00467在LAD组织中表达明显上调,并促进了LAD细胞的迁移和侵袭[10]。

代谢重编程是一种广泛存在肿瘤细胞中的生物学现象。越来越多的证据表明,LINCRNA可以与癌基因相互作用,也可以与抑癌基因相互作用,从而调节肿瘤细胞的能量代谢水平[11-14]。肿瘤发生发展过程中,癌细胞生长不仅需要大量ATP,癌细胞还允许糖酵解中间产物穿梭到几个生物合成途径中,产生核苷酸、NADPH、脂质和非必需氨基酸等物质,为合成大分子物质提供所需要的底物或中间体。同时,糖酵解还能够生成有助于细胞增殖的小分子前体或中间体,比如乙酰辅酶A、非必需氨基酸的中间体、核糖等物质,以此满足DNA快速复制的需要[15]。乳酸是癌细胞发生糖酵解最常见的产物,当乳酸堆积在细胞外基质中,并降低其酸碱度时,酸性的环境更加促进癌细胞的侵袭和转移[16-18]。因此,本研究对LINC00467影响调控能量代谢的现象进行描述,发掘代谢重编程在临床治疗中的潜在价值。

本研究首先使用qRT-PCR检测LINC00467在16HBE和两种LAD细胞株(A549和H1299)中的表达,结果发现癌细胞中的LINC00467水平高于正常细胞,为了进一步探究LINC00467的功能,我们使用平板克隆实验检测细胞增殖能力,Transwell实验检测了细胞的迁移能力,流式细胞术检测了细胞的凋亡率。结果发现,敲降LINC00467后细胞的增殖和迁移能力降低、凋亡比例增加。这些结果都提示LINC00467在LAD中扮演着促癌基因的角色。为了发掘LINC00467调控癌细胞代谢的能力,使用ATP检测试剂盒和乳酸检测试剂盒检测癌细胞,结果显示,敲降后细胞的ATP水平和乳酸含量明显降低,使用Western blot实验验证GLUT1和HK2的表达水平,结果表明,敲降LINC00467后癌细胞的GLUT1和HK2水平显著降低。这些结果都表明,LINC00467通过介导能量代谢重编程进而影响LAD细胞的增殖和迁移。

综上所述,我们发现敲降LINC00467可以降低LAD的能量代谢水平,从而降低LAD细胞的增殖及迁移能力。本研究存在不足之处,关于LINC00467如何调控代谢重编程的机制的阐述证据支持不足,希望能在后续的研究中进行补充完善。总之,LINC00467对于LAD能量代谢的调控作用可以为未来靶向治疗提供新的思路,具有一定的临床研究价值。