江苏地区代表性粳米香气组分差异分析

蒋森涛, 段晓亮, 吴长玲, 张 东, 商 博, 刘兴泉

(浙江农林大学食品与健康学院1,临安 311300)

(国家粮食和物资储备局科学研究院2,北京 100037)

江苏省是全国第二大粳稻主产区,粳稻种植面积约占全国粳稻面积的30%[1]。自2010年以来,我国粳米消费量呈不断增长态势[2]。面对不断扩大的市场,江苏地区涌现出了许多优质的粳米品种,如“优质食味粳米”南粳系列(南粳46、南粳9108、南粳5055等);出米率高、适口性好的“苏中稻王”淮稻5号;“长相青秀,熟色熟相俱佳”的苏秀867;具有高产稳产,优质、抗倒等特点的华粳5号。

大米香气直接影响适口性和消费者的接受度,在我国现行的大米食味品质评价标准中有着举足轻重的地位[3, 4]。良好的香气品质不仅能满足消费者对优质大米的需求,更能给种植户带来巨大的经济效益。大米香气主要受遗传因素的影响,另外,种植、加工、储藏等因素也会对大米香气产生一定影响[5-8]。目前对大米挥发物的报道中,主要针对储藏陈化过程中挥发物的变化[9-11],针对江苏代表性粳米品种香气组分差异的研究相对较少。

为明确江苏地区4种代表性粳米的香气特点,探究4种粳米之间香气组分差异,研究通过香气评价和HS-SPME-GC-MS技术定量分析了4种江苏代表性粳米的香气强度、组分,通过建立PLS-DA模型,找出对分类起关键作用的香气成分,并用热图和层次聚类分析(HCA)进一步阐述4种代表性粳米中香气成分的分布规律。为今后依据香气成分对粳米香型分类提供一定理论基础,同时为判别区分不同品种粳米、粳米品质鉴别和优质粳米的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用的江苏粳米品种为南粳46、南粳9108、华粳5号、淮稻5号,各品种样品数量分别为8、12、5、9,共计34个样品。南粳46取自江苏省南京(1),指样品数量,下同)、无锡(1)、苏州(5)、镇江(1)市不同区(县);南粳9108取自江苏省南通(2)、淮安(1)、盐城(4)、扬州(1)、镇江(1)、泰州(2)、宿迁(1)市不同区(县);华粳5号取自江苏省盐城(2)、宿迁(1)、连云港(2)市不同区(县);淮稻5号取自江苏省南通(1)、盐城(4)、扬州(2)、泰州(1)、宿迁(1)市不同区(县),收获年份为2021年,加工精度为精碾,于-20 ℃冰箱中密封保存。

二辛醇,色谱级,纯度99%;乙醇,色谱级,纯度99.8%;正构烷烃,色谱级,纯度99%。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2010plus气相色谱-质谱联用仪,Tissuelyser-24全自动样品快速研磨仪,LK5002电子天平,7X7-CER-HOT/STIR-230V-ADV热板搅拌器,2 cm聚二甲基硅氧烷/碳分子筛/二乙烯苯(DVB/CAR/PDMS)50/30 μm萃取进样头。

1.3 实验方法

1.3.1 粳米香气评价

米饭蒸煮参考GB/T 15682—2008;香气评价满分为10分,按照香气强度即浓郁程度打分,评价小组由4名受过培训的评价人员组成,每次评价需至少3名组员参与,最终得分取平均值。

1.3.2 粳米香气组分测定

1.3.2.1 样品前处理与制备

称取10.00 g粳米于全自动样品快速研磨仪中碾磨3次,碾磨功率为70 Hz,时间为5 s。取2.00 g的样品于20 mL磁吸螺旋盖小瓶中。在空白瓶加入用乙醇稀释10 000倍的二辛醇(0.822 g/mL)10 μL用来外标定量。所有样品均设置3个平行,每3个样品进行一次空白实验。

1.3.2.2 香气组分的萃取

将1.3.2.1的小瓶置于70 ℃水浴平衡20 min后,将经过老化的SPME萃取头(50/30 μmDVB/CAR/PDMS)插入小瓶中萃取40 min,于250 ℃进样口解析3 min后进行分析。

1.3.2.3 色谱条件

色谱柱为RXI-5MS极性柱(RESTEK;30 m×0.25 mm内径×0.25 μm膜厚)。色谱柱升温程序:柱初温为30 ℃,保持4 min,以5 ℃/min升温至250 ℃,保持在250 ℃下3 min。载气为高纯氦气,流速为1.5 mL/min,不分流。

1.3.2.4 质谱条件

进样口和检测器温度分别为250 ℃和230 ℃,传输线保持在250 ℃。使用正离子模式下的电子碰撞电离(70 eV),扫描范围为35～350m/z。

1.3.2.5 定性定量方法

质谱匹配通过与NIST2018版本2.0标准光谱进行比较,保留相似度≥80的化合物,并通过正构烷烃(C7～C30)保留时间计算的保留指数(RI)与文献中的RI值相比较。定量方法为相对定量:

挥发物含量=挥发物峰面积/(外标物峰面积)×(外标物含量)

1.4 数据分析

数据采用SPSS 22.0软件包进行分析。柱状图采用GraphPad Prism 9绘制。PLS-DA采用SIMCA14.1进行分析。热图和聚类分析采用OmicStudio工具:https://www.omicstudio.cn。

2 结果与分析

2.1 4种江苏粳米香气人工评价结果分析

通过人工评价,获得4种江苏粳米34个样品香气得分并进行差异分析比较,结果见表1。得分(指香气平均得分,余同)高低顺序为南粳46>南粳9108>华粳5号>淮稻5号;南粳46和南粳9108香气得分显著高于华粳5号,极显著高于淮稻5号;南粳46和南粳9108香气得分无显著差异,华粳5号和淮稻5号香气得分无显著差异;华粳5号组内差异最大。南粳46和南粳9108香气强度高于华粳5号和淮稻5号,南粳46、南粳9108与华粳5号、淮稻5号这2组虽然在得分上无显著差异,但它们在香气特点方面可能会有不同。华粳5号组内差异最大,表明华粳5号香气性状相对不稳定,容易受种植、加工、储藏等其他因素影响。

表1 4种粳米香气得分及组分含量/μg/kg

2.2 4种江苏粳米香气组分分析

通过顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)对江苏地区4种粳米34个样品的香气组分进行分析,通过外标定量法得到各组分含量(表1)。对4种粳米香气组分含量进行比较,结果如图1所示。由表1可知,除去对香气贡献较小的烷烃类[12-14]和常见的柱流失杂质[15],鉴定出5类香气化合物,分别为醛类13种、酮类6种、烯烃类5钟、杂环类3种和酯类2种,共计29种香气成分。对比发现,醛类化合物含量远超于其他4类化合物总和,表明醛类化合物与4种江苏粳米的香气组成密切相关,其中己醛、壬醛为醛类主导组分,在低浓度时具有甜味、柑橘、玫瑰等香气[16],且除杂环类化合物南粳9108>南粳46外,其余4种主要类别化合物含量由高到低顺序为南粳46>南粳9108>华粳5号>淮稻5号,这与香气得分结果一致,表明这4种粳米香气的浓郁程度与这些类别化合物含量存在一定的正相关。此外,对于醛类化合物含量,南粳46显著高于华粳5号,极显著高于淮稻5号,南粳9108极显著高于淮稻5号;对于酮类化合物含量,南粳46和南粳9108极显著高于淮稻5号;对于烯烃类化合物含量,南粳46极显著高于淮稻5号;对于杂环类化合物含量,南粳46和南粳9108极显著高于淮稻5号;对于酯类化合物含量,南粳46和南粳9108极显著高于淮稻5号。结果表明,南粳46与南粳9108较另外2种粳米更具甜香味且风味组成更丰富。

注:采用Kruskal-Walls检验,**为不同品种间差异达到极显著水平(P≤0.01);*为不同品种间差异达到显著水平(P≤0.05);大写字母为不同品种间两两比较结果差异极显著(P≤0.01);小写字母为差异显著(P≤0.05)。

2.3 4种江苏粳米香气组分偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)

2.3.1 PLS-DA模型构建

对江苏地区4个粳米品种共计34个样品的香气组分进行PLS-DA分析。图2为PLS-DA得分图,其中,R2(X)=0.855,R2(X)越接近1,模型越稳定;R2(Y)=0.731,R2(Y)越大,模型的解释能力越强,说明该模型可以解释73.1%的数据;Q2=0.660,Q2>0.5,说明模型的预测能力较强。由图2可知,淮稻5号主要通过主成分2与南粳9108进行区分,通过主成分1与南粳46进行区分。南粳46和南粳9108主要通过主成分2进行区分。华粳5号主要通过主成分2和南粳9108进行区分。根据Hotelling T2分布,所有样品均处于99%置信区间内,未发现明显离群样本点,说明建立的PLS-DA模型可对4种江苏粳米样品有效分类。

图2 PLS-DA得分图

2.3.2 模型可靠性验证

分别对4个江苏粳米的判别模型进行20次置换验证,4个模型Q2的一元线性回归曲线在纵轴上的截距均小于0,说明4个模型不存在过拟合现象,模型可靠,可用于4种江苏粳米的判别分析。

2.3.3 对4种江苏粳米判别起关键作用香气成分的鉴定

在图3模型因子载荷图中,离密集区越远的变量对分类的作用越关键。同时结合29种香气成分的变量重要性(VIP)值图, VIP值可以量化PLS-DA模型中每个变量对分类的贡献,通常认为VIP值大于1的变量是关键变量,对分类起着关键作用[17]。本实验共有10种香气成分VIP值大于1,分别为吲哚、2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)、柠檬烯、苯甲醛、2,3-辛二酮、己醛、萘、苯乙酮、长叶烯、丁酸丁酯。除丁酸丁酯外,其余化合物均为离密集区较远的变量。在图3中,离组别(Y)越近的变量(X)在该组样品中的含量越高。萘、长叶烯、苯乙酮在南粳46样品中含量较高,分别具有香樟木气味、木香、花香[16],且长叶烯能使香气特性更持久[18];2-乙酰-1-吡咯啉、柠檬烯、苯甲醛、2,3-辛二酮、己醛在南粳9108样品中含量较高,分别具有爆米花香、柠檬香、苦杏仁味、奶香、甜味[16];吲哚在淮稻5号中含量较高,在低浓度时为花香[19],高浓度则提供一种令人不悦的霉味[23];华粳5号各香气成分含量较为均匀。由结果可知南粳46香气浓郁持久,南粳9108香气丰富香甜,华粳5号香气较为柔和,淮稻5号香气则相对寡淡。

图3 PLS-DA模型因子载荷图

对于VIP值大于1的10种香气成分,对它们在4种粳米之间的含量差异进行分析。通过非参数Kruskal-Wallis检验,结果如表2所示,吲哚、2-乙酰-1-吡咯啉、柠檬烯、苯甲醛、2,3-辛二酮、己醛、苯乙酮、丁酸丁酯这8种香气成分含量在不同品种粳米间均有极显著差异(P≤0.01),萘的含量在不同品种粳米间有显著差异(P≤0.05),长叶烯的含量在不同品种粳米间无显著差异。因此,结合VIP值>1的变量和非参数检验Kruskal-wallis检验的差异显著性结果,鉴定出9种香气成分是区分江苏地区4种粳米的关键香气成分,分别为吲哚、2-乙酰-1-吡咯啉、柠檬烯、苯甲醛、2,3-辛二酮、己醛、苯乙酮、丁酸丁酯、萘。

表2 PLS-DA模型中VIP值大于1的香气成分P值及香气特征

2.4 4种江苏粳米9种关键香气成分层次聚类分析(HCA)

为进一步探究9种关键香气成分在江苏地区4种粳米之间含量的分布情况,通过绘制热图,并采用HCA法对9种香气成分进行聚类,结果见图4。对于样品的聚类主要分为3大类,Ⅰ区样品包含南粳46、南粳9108和小部分华粳5号,香气成分总体含量较其他样品偏高;Ⅱ区样品包含南粳46和南粳9108,香气成分总体含量处于所有样品里的中间水平;Ⅲ区样品包含淮华粳5号、淮稻5号和1个南粳46样品,香气成分总体含量较低。

注:Ⅰ区第3、4、12列为华粳5号,Ⅱ区倒数第3列(右往左)和Ⅲ区第7列为南粳46。

从品种来看,南粳46、南粳9108的香气成分明显区分于华粳5号和淮稻5号,且前者的香气成分总体含量显著高于后者;2-乙酰-1-吡咯啉在南粳46、南粳9108、华粳5号中均有检出,淮稻5号未检出,且可以明显区分华粳5号和淮稻5号;南粳46和南粳9108的样品之间区分度较低,这可能是因为它们同为南粳系列品种且亲本来源都为武香粳14(♀)和关东194(♂)[21];在Ⅰ区香气成分含量较高样品中混有华粳5号及Ⅲ区香气成分含量较低样品中混有南粳46,这表明粳米的香气组分含量除了与品种有较大关系外,可能还有诸如产地、种植条件、加工储藏等其他影响的因素[6-8]。有研究表明,灌浆期低温16～22 ℃更有利于2-乙酰-1-吡咯啉等香气成分在大米中的积累[22, 23]。

从关键香气组分的聚类来看,Ⅰ区的吲哚在淮稻5号的样品中含量高于其他3个品种的大部分样品,是淮稻5号的特征香气成分。吲哚的形成涉及从L-谷氨酰胺和分支酸起始的L-色氨酸生物合成途径[12],在水中的气味阈值为500 ng/g,在低浓度时呈现花香,高浓度时则呈现令人不悦的霉味和粪臭味。Ⅱ区的柠檬烯在大部分南粳9108、部分南粳46和部分淮稻5号样品中含量较高,被认为是米糠中所含有的烯萜类物质[19],呈现柑橘类的清新气味。Ⅲ区的苯乙酮和萘在大部分南粳46、部分南粳9108和部分华粳5号中含量较高,苯乙酮由肉桂酸为中间体通过L-苯丙氨酸生物合成[6],具有一定的花香;萘在水中的气味阈值为50 ng/g,高浓度的萘会有一种刺鼻的樟脑丸感受,对大米的香气造成一定负面影响。Ⅳ区的2,3-辛二酮在4种江苏粳米样品中均有一定分布,主要呈现奶香、甜味。Ⅴ区的己醛在南粳46、南粳9108样品中含量较高,在华粳5号、淮稻5号样品中含量较低,2-乙酰-1-吡咯啉未在淮稻5号样品中检出,在其他品种中均有分布,且含量较为均衡。己醛由亚油酸通过脂氧合酶途径生成,被认为是脂质氧化标记物,空气中的气味阈值为1.1 ng/L,在低浓度时为甜味、果香、青草香气,高浓度时则呈现汗味等异味。2-乙酰-1-吡咯啉是香米和非香米的重要标志物,在水中的阈值为0.1 ng/g,在空气中的阈值仅为0.02～0.04 ng/L,能赋予大米类似爆米花、烤谷物、麦芽的香气,这是典型的香米香气特征[5, 24]。一般认为,2-AP的产生的主要是因为香米中第8号染色体上的基因BADH2突变所造成[5, 25, 26]。Ⅵ区的苯甲醛和丁酸丁酯在大部分淮稻5号和华粳5号样品中含量较低,在大部分南粳46和南粳9108样品中含量较高。有研究认为苯甲醛可以通过2,4-癸二烯醛在一定环境条件下氧化产生,或者通过脂质氢过氧化物分解产生的自由基降解苯丙氨酸形成[6],它在水中的气味阈值为200～500 ng/g,提供类似苦杏仁的香气;丁酸丁酯则呈现清新、浓郁的果香。由此可知,南粳46、南粳9108香气组成较为类似,主要特征香气成分为己醛、2-乙酰-1-吡咯啉、苯甲醛、丁酸丁酯;华粳5号主要特征香气成分为2-乙酰-1-吡咯啉;淮稻5号主要特征香气成分为吲哚。柠檬烯、苯乙酮、萘、2,3-辛二酮这4种成分在江苏粳米样品中均有分布,奠定了江苏粳米偏甜香型的香气基调,该结果与PLS-DA判别模型分析结果一致。

3 结论

研究通过香气评价对4种江苏粳米香气浓郁程度进行评价,得分高低顺序为南粳46>南粳9108>华粳5号>淮稻5号;通过HS-SPME-GC-MS技术对江苏4种主要粳米的香气组分进行分析,共鉴定出29种香气成分,其中醛类为主要化合物,且品种间香气成分含量除杂环类南粳9108>南粳46外,其余种类化合物含量高低顺序与香气得分顺序相同,表明这些类别化合物含量与香气浓郁程度存在正相关,南粳46与南粳9108更具甜香味且风味组成更丰富;基于4种江苏主要粳米香气成分的PLS-DA判别模型分析可有效区分4种粳米,且模型可靠:南粳46香气浓郁持久,南粳9108香气香甜丰富,华粳5号香气柔和宜人,淮稻5号香气略显寡淡;通过VIP值和非参数Kruskal Wallis检验最终鉴定出9种关键香气成分,分别为吲哚、2-乙酰-1-吡咯啉、柠檬烯、苯甲醛、2,3-辛二酮、己醛、苯乙酮、丁酸丁酯、萘;通过绘制热图及HCA法结果表明,南粳46、南粳9108特征香气成分为己醛、2-乙酰-1-吡咯啉、苯甲醛、丁酸丁酯;华粳5号特征香气成分为2-乙酰-1-吡咯啉;淮稻5号特征香气成分为吲哚。柠檬烯、苯乙酮、萘、2,3-辛二酮这4种成分构成了江苏粳米偏甜香型的香气基调。了解区域粳米香气组成对于粳稻区域品种、风味组成、米香驻留时间等产品品质快速鉴定,以及推动粳稻产业健康发展具有较大的意义。