桃红四物汤抗纤维化作用及机制的研究进展

喻玉林，文 尚，张敏轶，张 璋，谢 辉*，郭锦材*

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.长沙市口腔医院，湖南 长沙 410006

纤维化是以细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积为特征的慢性病理性过程，可发生在各种器官和组织中，以肝、肾、肺、心肌、黏膜最为常见[1]。 纤维化的持续发展可致器官功能障碍甚至衰竭，严重危及人类生命健康，而其发病机制复杂，且目前无特异性治疗药物[2]。 因此，寻找高效、不良反应小的药物治疗纤维化疾病成为研究的热点。

桃红四物汤(Taohong Siwu Decoction, THSWD)是由桃仁、红花、当归、川芎、熟地黄、白芍组成的中药复方，现代药理学研究显示THSWD 具有抗炎、抗氧化等作用[3]。 近年，从临床回顾、体内和体外实验等多方面展开了对THSWD 的研究，发现其具有抗心肌纤维化、抗肝纤维化、抗肺纤维化、抗口腔黏膜下纤维化的作用[4-6]。本文就THSWD 抗纤维化作用及机制进行综述，为临床纤维化疾病治疗提供新思路。

1 THSWD 抗纤维化作用的临床研究

临床研究发现，由慢性疾病引发器官（组织）纤维化的患者经THSWD 治疗后，可改善纤维化指标及器官（组织）功能。 王舜[7]以干扰素注射为对照组，在对照组的基础上联合THSWD 治疗慢性乙型肝炎肝纤维化患者，连续治疗6 个月后，检测两组治疗的临床疗效、肝纤维化指标和肝功能指标，发现THSWD组临床总有效率达94.64%，明显高于对照组的66.07%，同时THSWD 组肝纤维化指标透明质酸（hyaluronic acid,HA）、Ⅲ型前胶原蛋白（procollagen type Ⅲprotein, PC-Ⅲ）、层粘连蛋白（laminin, LN）及Ⅳ型胶原蛋白（ⅣCollagen, Col-Ⅳ）水平降低，肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平，较干扰素治疗组明显下调。说明THSWD 能提高肝纤维化临床疗效，降低肝纤维化指标，改善肝纤维化程度。

孙燕[8]在收治的102 例口腔黏膜下纤维化患者中发现，常规用西药醋酸泼尼松龙和利多卡因混悬液注射治疗，患者发生毒副反应大，易出现一系列不良反应。而在西药组基础上用THSWD 对症治疗，毒副反应发生率仅为1.09%，明显低于西药组的15.67%。同时THSWD 组患者张口度、口腔黏膜质地及颜色均得到改善，临床总有效率达82.35%，明显高于西药组的45.10%。

纤维化是各种器官慢性疾病的结局，因此，通过抑制慢性疾病进展，可能逆转纤维化。而THSWD 被证实可延缓慢性心力衰竭及慢性肾脏疾病进展[9-10]。王银庄等[11]在THSWD 化裁治疗慢性心力衰竭临床研究中发现，常规强心、利尿基础治疗，仅改善心衰临床症状，对患者的疾病形成基础尚无显著疗效。而采用THSWD 联合基础治疗，患者心功能指标、血清学指标改善；同时，患者血清中促纤维化因子基质金属蛋白酶-9（matrix met-alloproteinase-9, MMP-9）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）水平降低，具有良好的临床疗效。杨俊等[12]采用氢氯噻嗪联合THSWD、五苓散加减治疗慢性肾衰竭，两个疗程后，患者肾功能改善，炎症因子水平减少，且未出现严重的不良反应。

综上表明，THSWD 治疗纤维化疾病能提高临床疗效，减少不良反应发生，改善相关纤维化指标及脏器功能指标，具有较好的抗纤维化作用，并能延缓疾病进程，抑制或逆转纤维化。

2 THSWD 抗纤维化作用的实验研究

2.1 THSWD 在肝纤维化模型中的作用

肝纤维化是慢性或反复性肝损伤演变的病理结果，最终可导致肝硬化，甚至肝细胞癌[13]。THSWD 对肝纤维化小鼠模型具有治疗作用，刘旭凌等[14]发现CCl4诱导的肝纤维化小鼠经THSWD 治疗后，肝纤维化小鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平降低，肝组织中炎症面积减少，α-平滑肌肌动蛋白 （αsmooth muscle actin, α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白及相关基因表达下调。表明THSWD 能改善肝功能、减少肝组织中胶原水平，减缓肝纤化。 另外，邱勇[15]和王桐生等[16]研究发现THSWD 能降低CCl4诱导的肝纤维化鼠血清中的HA、LN、Col-Ⅳ水平，还能减少肝组织中羟脯氨酸含量以及减轻肝小叶结构破坏程度。 表明THSWD 能改善肝纤维化指标，维护肝脏正常结构，发挥抗肝纤维化作用。

2.2 THSWD 在肺纤维化模型中的作用

肺纤维化是慢性肺病发展到晚期的常见病理表现，肺组织瘢痕形成、胶原沉积是其主要病理特征，最终可引发呼吸衰竭致死[17]。 于小寒[18]研究表明THSWD 可改善肺纤维化大鼠的生存状态，减轻肺纤维化程度。 其用博来霉素诱导建立肺纤维化大鼠模型，THSWD 进行干预后，发现THSWD 组大鼠肺组织病理切片中无明显炎症浸润，肺泡和肺泡壁形态未见病理性改变，Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白表达下调。表明THSWD 能抑制炎症浸润，减轻肺组织损伤，改善肺纤维化。

2.3 THSWD 在肾纤维化模型中的作用

肾纤维化是慢性肾病发展到终末期的病理表现，最终可致肾衰竭[19]。 吴雪兵等[20]观察THSWD 对牛血清白蛋白诱导的肾纤维化大鼠模型的作用，用管饲养法输送THSWD 干预肾纤维化大鼠，4 周后取大鼠血清，采用酶联免疫吸附测定血肌酐、血尿素氮水平，透射电镜观察肾小球系膜区增生情况，免疫荧光染色检测Col-Ⅳ表达。 结果发现THSWD 组大鼠血清中血肌酐、尿素氮水平降低，肾组织系膜区ECM 沉积减少，Col-Ⅳ荧光呈下调趋势。 表明THSWD 能改善肾功能及肾纤维化指标，发挥抗肾纤维化作用。

2.4 THSWD 在心肌纤维化模型中的作用

心肌纤维化是心肌梗死等慢性心血管疾病的中心环节，心肌组织内ECM 堆积是其主要特征，最后可致心脏功能衰竭[21]。李杏等[22]探究THSWD 对心肌梗死诱发心肌纤维化大鼠的影响，采用多普勒超声心动图检测大鼠心功能、Masson 染色检测大鼠的心肌组织改变，发现THSWD 处理组中，大鼠心脏射血分数上调，心肌间质纤维化程度减轻，另外还采用免疫组织化学法检测大鼠心肌组织中Ⅰ型胶原蛋白与Ⅲ胶原蛋白比值表达，发现THSWD 组大鼠心肌组织中Ⅰ型胶原蛋白与Ⅲ胶原蛋白比值表达下调。 表明THSWD 能下调心肌组织中的胶原蛋白表达，改善心功能，减轻心肌纤维化程度。

以上实验表明THSWD 能减少各器官组织内胶原以及ECM 沉积，改善肝、肺、肾、心肌功能，抑制纤维化发展，减轻纤维化程度。

3 THSWD 抗纤维化的作用机制

目前关于THSWD 抗纤维化作用机制尚未明确，但近年学者们进行了大量探究，具体如下。

3.1 调控TGF-β/smads 信号通路

纤维化发病机制复杂，其发生发展受多种信号通路及细胞因子调控，其中TGF-β/smads 信号通路已被证实在纤维化疾病中发挥重要的作用[23]。 TGFβ 是目前公认的参与纤维化发生及发展的重要调控因子[23]。Smads 蛋白是TGF-β 下游的信号蛋白，其分为受体激活型、 共同介质型、 抑制型3 种， 其中smad2、smad3 属于受体激活型，具有促纤维化作用[24]。TGF-β 激活后与受体（TGF-βRⅡ、TGF-βRⅠ）结合，形成的受体复合物使受体激活型的smad 蛋白磷酸化，磷酸化后的smad 蛋白能够将TGF-β 信号从细胞外传递至细胞核，形成经典的TGF-β/smads 信号通路，调控成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，诱导胶原合成，促使ECM 过度沉积，推进纤维化进程[25]。此外，TGF-β 受体还能直接激活其他细胞内信号通路，形成非经典的TGF-β 信号通路，如ERK、PI3K/AKT 通路，促进纤维化发生[26]。

肺组织损伤以及修复过程中释放的中性粒细胞、巨噬细胞等均能分泌、激活TGF-β1，使TGF-β1表达上调，进而刺激下游蛋白smad2/3 与smad4 结合，调节促纤维化介质靶基因转录，推进肺纤维化发生发展[27]。 在肺纤维化中，TGF-β1/smads 信号通路激活主要作用有：（1）使成纤维细胞转化为肌成纤维细胞；（2）使肺泡上皮/内皮细胞转化成间充质细胞；（3）下调ECM 降解酶表达，使ECM 异常沉积。此外，在探究心肌纤维化靶点基因及信号通路的研究中，发现TGF-β 过表达，可促进心肌成纤维细胞增生，使Ⅰ型胶原蛋白与Ⅲ型胶原蛋白mRNA 和蛋白表达上调，推进心肌纤维化进展[28]。 说明抑制TGF-β活性，阻断TGF-β/smads 信号通路，是延缓肺纤维化和心肌纤维化发展的有效靶点，而研究表明THSWD能调控TGF-β 相关靶点。

于小寒[18]用THSWD 干预博来霉素注射液诱导的肺纤维化大鼠后，采用RT-PCR 检测大鼠肺组织中TGF-β1、smad3 mRNA、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白表达，另外采用Western blot 检测p-smad3 蛋白表达，结果发现与模型组相比，THSWD 组TGFβ1、smad3 mRNA、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、psmad3 蛋白表达均呈下调趋势，说明THSWD 能降低TGF-β1 及其下游smad3 蛋白活性。 提示THSWD可能是通过下调smad3 表达，阻断TGF-β1 传导，进而抑制TGF-β/smad3 信号通路激活，减少肺组织中胶原合成，达到抗肺纤维化目的。此外，THSWD 在抗心肌纤维化中也有相关作用。TAN 等[29]研究THSWD对心肌纤维化的干预作用机制，采用转录组学方法检测到THSWD 组大鼠心肌组织中TGF-β 受体TGFβRⅠ及下游smad2/3 蛋白表达下调，说明THSWD能抑制TGF-βRⅠ及下游smad2/3 蛋白表达，提示THSWD抗心肌纤维化的机制可能是通过抑制TGF-β 受体过表达，进而阻断下游smads 信号通路激活，发挥抗心肌纤维化作用。

3.2 调控ERK 信号通路

ERK 信号通路是MAPK 家族中的重要成员之一，其参与细胞增殖、周期调控、分化、凋亡等，ERK1/2是目前研究最多的信号通路[30]，ERK 能被多种细胞因子刺激，如TGF-β、血管紧张素，随后经Ras/Raf/MEK/ERK 途径，进而激活，发挥调控细胞增殖、凋亡作用。 KIM 等[31]研究表明，激活的ERK 信号通路是引发成纤维细胞增殖活化，诱导ECM 沉积，促进纤维化的重要因素。 且近年有研究发现糖尿病肾病引发的肾纤维化大鼠，纤维化程度随ERK 蛋白表达升高而逐渐加重[32]。此外，在单侧输尿管梗阻的大鼠肾纤维化模型中，抑制ERK 激活，能减少α-SMA、Ⅲ型胶原蛋白表达[33]，提示ERK 信号通路与肾纤维化密切相关。

马进等[34]研究发现，THSWD 干预肾成纤维细胞BALB/c3T3，采用CCK-8 法检测细胞增殖、活性，发现THSWD 组BALB/c3T3 细胞生长速度及活性均较空白组降低，Western blot 检测到THSWD 组ERK1/2、p-ERK 蛋白表达较空白组明显下调。 表明THSWD 能抑制ERK、p-ERK 蛋白，提示THSWD 可能通过抑制ERK 信号通路激活，从而抑制肾成纤维细胞增殖、活化，改善肾纤维化程度。 这一结果也在体内实验THSWD 可抑制肾纤维化大鼠中得到印证，THSWD 降低肾纤维化大鼠肾组织中ERK1/2 蛋白表达，抑制肾纤维化发展[20]。

近年，相关研究表明，ERK 信号通路与肝星状细胞增殖也有密切关联。 磷酸化的ERK1/2 进入细胞核内，调节转录因子及细胞周期蛋白D/E 表达，促进肝星状细胞有丝分裂及增殖活化，推动肝纤维化发生发展[35]。蔡锐等[36]发现THSWD 加味方能调控人肝星状细胞增殖和凋亡，抑制肝纤维化进程。 由此推测THSWD 加味方降低肝星状细胞增殖，抑制肝纤维化进程可能与调控ERK 信号通路有关，但其作用机制有待进一步探究。

3.3 调控PI3K/AKT 信号通路

PI3K 是胞内的磷脂酰肌醇激酶，PI3K 激活后与其下游蛋白AKT 结合，形成PI3K/AKT 信号通路，发挥抗细胞凋亡等重要作用[37]。 细胞凋亡是一种发生在生物体内受多种基因调控的细胞程序性死亡，细胞凋亡与肺纤维化[38]、肾纤维化[39]以及口腔黏膜下纤维化[40]有着密切关联。 而近期ZHANG 等[28]研究表明，心肌细胞的凋亡、坏死可加快心肌成纤维细胞分化及胶原沉积，推进心肌纤维化进程。 因此，调控PI3K/AKT 信号通路，是抗纤维化的一种重要途径。

LUO 等[41]研究表明，THSWD 能降低心肌梗死大鼠模型心肌细胞凋亡，上调心肌组织中的AKT、PAKT 蛋白表达，并能增加类胰岛素性生长因子（insulin-like growth factor-1, IGF-1）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的表达。 说明THSWD 能激活AKT、P-AKT 蛋白，增加心肌细胞抗凋亡活性。而前期有研究发现，IGF-1 可激活PI3K/AKT 信号通路，发挥抗心肌细胞凋亡作用[42]。在心肌纤维化中，THSWD 不仅可以下调心肌胶原蛋白生成，而且可以通过激活PI3K/AKT，调控心肌组织中微血管生成，减少心肌细胞凋亡。提示THSWD抗心肌纤维化机制可能是通过上调IGF-1，激活PI3K/AKT 信号通路，进而抑制心肌细胞凋亡，促进心肌组织血管生成，改善心肌微循环，达到抗心肌纤维化目的。

3.4 调控细胞因子及炎症通路

炎症因子是纤维化启动及发展的重要因素[43]，其中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNFα）、白细胞介素-6（interleukin 6, IL-6）、白细胞介素-1（interleukin 1, IL-1）是促纤维化的重要炎症细胞因子[44]。 研究发现，肺纤维化初期，巨噬细胞会释放大量TNF-α、IL-6、IL-1，激活相关炎症通路，如NF-κB，推动肺纤维化发展[45]。且相关研究表明IL-6、IL-1 在肺纤维化不同时段发挥重要作用，IL-1 出现于肺纤维化早期，刺激成纤维细胞转化及胶原蛋白合成，而IL-6 表达随着肺纤维化的严重程度上调，并与ECM 重要组成成分HA、LN 等呈正相关。 在口腔黏膜下纤维化中，炎症因子也同样参与全程病变[46]。因此，抵制炎症因子及相关信号通路，是改善肺纤维化、口腔黏膜下纤维化的重要策略。

周勇等[47]研究发现，THSWD 能下调肺纤维化大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平，降低肺组织内炎症浸润，使肺纤维化病理改变得到改善。而通过网络药理学分析THSWD 抗口腔黏膜下纤维化的有效成分及机制中发现，THSWD 抑制口腔黏膜下纤维化的机制可能与下调IL-17、NF-κB 等炎信号通路相关[48]。 提示THSWD 抑制肺纤维化和口腔黏膜下纤维化作用机制可能与下调炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β 及相关信号通路NF-κB 有关。

3.5 调控基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）及其抑制剂

组织内ECM 合成增多，降解减少，是引发ECM过度沉积，推进纤维化进程的重要原因[49]。 因此，增强ECM 降解也是抑制纤维化发展的一种重要途径。而MMP 和金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP）是调控ECM 生成与降解的关键酶[50]。MMP 降解ECM，TIMP 抑制MMP 活性，抑制其降解ECM 的能力[51]。 因此，调节这两种关键酶是抗纤维化的理想策略，而近年研究发现THSWD 具有调控MMP、TIMP 活性的作用。

王桐生等[16]在研究THSWD 对肝纤维化模型影响时，发现THSWD 上调肝组织中MMP-1 表达，下调TIMP-1 表达，说明THSWD 能增强MMP 活性，加强ECM 降解，降低TIMP 活性。 提示THSWD 抗肝纤维化机制可能是通过调控MMP 和TIMP 活性，使MMP/TIMP 达到平衡，共同维护肝细胞微环境稳态，进而抑制肝纤维化发展。

综上所述，THSWD 可通过调控TGF-β/smads、ERK、PI3K/AKT、NF-κB 信号通路，炎症因子IL-6、IL-1β 以及ECM 相关降解酶蛋白，抑制肺、肾、心、肝及口腔黏膜下纤维化发生发展。 详见表1。

4 总结与展望

综上所述，THSWD 能提高纤维化患者的临床疗效，并经体内体外实验均证实其具有抗纤维化作用，而其作用机制可能通过调控TGF-β/smads、ERK、PI3K/AKT、NF-κB 信号通路，炎症因子IL-6、IL-1β以及ECM 相关降解酶蛋白来实现的。炎症反应是纤维化疾病的始动环节，其慢性持续性进行，可释放促纤维化炎症因子及TGF-β 等细胞因子，而TGF-β可激活相关的信号通路，是推动纤维化疾病发展的关键环节。 THSWD 可以调控炎症因子、炎症通路、TGF-β 及其信号通路。 提示在器官及组织纤维化早期，可利用THSWD 抑制纤维化进展，进而逆转纤维化。 此外，网络药理学研究发现THSWD 还能调控Wnt 通路，而Wnt 信号通路是口腔黏膜下纤维化恶变的重要信号通路[48]，说明THSWD 治疗口腔黏膜下纤维化的临床应用前景可期。

在各纤维化模型中，THSWD 呈现了通过多途径、多靶点发挥抗纤维化作用，但通过文献总结及分析发现，THSWD 在抗纤维化研究中还存在一些问题有待解决。 第一，THSWD 抗纤维化的临床研究报道较少，且报道时间相对久远，样本量少，且质量不高；第二，研究范围相对局限，主要集中于肝纤维化研究中，肾、肺、心肌以及口腔黏膜下纤维化相关研究偏少；第三，发现THSWD 抗各器官纤维化，甚至是同类型纤维化时，其单味中药以及干预剂量均有差异，缺少相关的剂量标准以及药效最优配比研究。 因此，在未来研究中应注意：（1）扩大样本量，加强其相关临床研究，并与基础研究相结合；（2）扩展THSWD 对不同类型纤维化疾病的影响，深入探讨其防治各类纤维化疾病的机制；（3）针对THSWD 剂量和配比问题，可根据研究内容采用均匀设计等方法，寻找到安全剂量以及最优配比，为中药复方配伍提供更充分、更科学的依据，进一步推进中医药在抗纤维化疾病中的研究。