牛结节性皮肤病研究进展

程肖晔，王晓亮，常广军，左冉坤，沈向真*，李知新*

(1. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095；2. 宁夏动物疾病预防控制中心，宁夏 银川 750000)

牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，LSD)是一种由痘病毒科的结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus，LSDV)导致的牛传染性疾病[1]，是一种急性至亚急性的疾病，其特征是发热、皮肤黏膜及内脏结节、消瘦、淋巴结肿大、皮肤水肿，有时甚至死亡。LSDV感染的发病率差异很大(5%～45%)，一般来说，其死亡率小于10%，但发病率高达90%[2]，能够在短时间内出现在距离最初(局灶性)暴发地点几百公里的地方。牛群患病后，身上会出现大量的皮肤结节，损害皮肤的完整性影响皮革生产，食欲减退体重下降。除此之外，LSD还会影响奶牛产乳性能，导致产奶量急剧下降，有时还会导致死亡，严重影响奶牛经济产业的发展。

1 病原学

1.1 病毒特征

引起牛结节性皮肤病的LSDV与绵羊痘病毒(sheeppox virus，SPPV)的同源性高达98%以上，与山羊痘病毒(goatpox virus，GTPV)基因组核苷酸之间的同源性高达96%，三者只能通过分子特征来进行区分。LSDV在电镜下呈椭圆形或砖形，覆盖着短管结构，病毒粒子大小约320 nm×260 nm[3]。痘病毒中的正痘病毒可以引起水牛痘，病毒粒子由1个核心、2个侧体和2层脂质外膜组成，是动物病毒中体积最大、结构最复杂的病毒。与许多在宿主细胞核中复制的 dsDNA 病毒不同，痘病毒有自己的复制机制，因此在细胞质中复制；病毒基因以双相方式表达，早期基因编码参与基因组复制的非结构蛋白，晚期基因编码病毒结构蛋白。

1.2 基因组功能

LSDV基因组是双链DNA，含有156个开放阅读框(ORF)，由一个被2.4 kb的末端反向重复序列(ITR)包围的中间编码区域和156个假设基因组成[4]。痘病毒的进化通常是通过基因丢失和缩小宿主范围而进行的，通过基因组序列分析发现，在SPPV、GTPV和LSDV的端粒中也有同样的基因丢失模式[5]。SPPV和GTPV的大多“管家”基因氨基酸序列原本与LSDV有98%以上的同源性，但由于插入剪切和移码突变，有3个蛋白质家族的C末端结构域发生改变，于是SPPV和GTPV与LSDV中的ORF_138基因同源性降低到了84%[5]。LSDV的基因功能包括复制、结构和组装、转录和翻译、生长和凋亡、锚蛋白重复、宿主免疫逃避、毒力、假定蛋白和体液免疫等[6]。

1.3 免疫机理

痘病毒在感染宿主细胞过程中，通过抑制宿主细胞中白介素-1(IL-1)的合成和释放，编码可溶性细胞因子如：肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-1和干扰素-γ(IFN-γ)等，合成病毒编码的类表皮生长因子和类转化生长因子等，对抗宿主细胞介导的抗病毒免疫作用，从而逃避宿主的天然免疫和适应性免疫[7]。山羊痘病毒的免疫逃避主要通过细胞介导，除了通过受感染细胞的出芽释放到细胞外的包膜病毒粒子外，大多数病毒仍留在受感染的细胞内。这些细胞可能会感染邻近的细胞或使病毒逃到血液中传播到全身。据报道，皮内接种后，SPPV和GTPV能够感染单核细胞/巨噬细胞，表明这些细胞可能有助于病毒的全身性传播[8]。最近有研究显示痘病毒还可能使用 G 蛋白偶联的趋化因子受体样蛋白来促进免疫逃避[9]。ORF_138是山羊痘病毒属共有的基因，其作用类似于OX-2样蛋白，OX2/CD200家族蛋白通过膜定位和与CD200R受体的特定相互作用，下调体内巨噬细胞和T细胞活性，并抑制抗原启动。山羊痘病毒属(CaPVs)成员在基因组水平上有95%以上的相似性，因此所有CaPVs都具有共同的主要抗原，从自然感染中恢复的动物能够抵抗再感染。然而，最近在中东和非洲之角暴发牛结节性皮肤病的现场经验表明，这种交叉保护只是部分的[10]。

2 流行病学

2.1 国内外流行情况

LSDV起源于非洲，自2012年以来，该疾病迅速而广泛地传播到中东和巴尔干地区、南部高加索地区和俄罗斯联邦的部分地区。牛结节性皮肤病是一种死亡率低的牛类疾病，在非洲，这种疾病的平均发病率为10%，患病牛群的死亡率为1%。在疫苗接种充分发挥作用之前，该疾病迅速从一个地区传播到另一个地区[12]。2015年，牛结节性皮肤病蔓延到希腊，2016年，欧洲东南部7个国家，即希腊、保加利亚、北马其顿、塞尔维亚、科索沃、阿尔巴尼亚和黑山，还有沙特阿拉伯、俄罗斯、亚美尼亚、格鲁吉亚和哈萨克斯坦也报告了疫情[12]。2018年，该病蔓延到东欧国家。

2019年该病传入我国新疆地区并首次确诊[13]，截至目前，中国7个省共报告了8例LSD暴发。8次暴发的总发病率和死亡率分别为19.5%(156/801)和0.9%(7/801)。每一次单独暴发的发病率和死亡率分别为6.6%～100%和0～16.7%。在1年之内，LSDV在中国最西部和最东部的省份先后被确定，甚至到达了中国大陆以外的台湾岛。福建、山东、四川、宁夏等各省份(自治区)牛结节性皮肤病疫情均是由外购牛引起。截至2021年9月，国内共17个省(自治区、直辖市)陆续公布了牛结节性皮肤病疫情[14](如表1)。这无疑是对中国牛养殖行业的重大威胁，为了保证相关贸易的安全进行，我国在实验室诊断、支持治疗、场所消毒和疫苗接种等方面的投入是巨大的[11]。

2.2 传播途径

研究表明，在没有合适昆虫的情况下，动物间没有发生疾病传播，未表现临床症状，动物的口腔、鼻腔或结膜中也没有检测到病毒[15]。在大多数情况下，LSDV的长途传播与动物的运动有关，但明显的季节性模式表明，节肢动物很可能是疾病迅速传播和短期传播的主要原因。到目前为止，LSDV传播最有可能的媒介是吸血节肢动物，如稳定蝇(枸橼酸蝇)、蚊子(埃及伊蚊)和硬蜱(头蝇和钝虫)[12]。节肢动物可以通过结膜、皮内和静脉传播LSDV。有研究显示，与皮内接种相比，静脉接种LSDV会对宿主产生更明显的临床症状[15]。从长期受感染动物的精液中可以分离出LSDV，表明LSDV也可通过精液传播。

2.3 易感动物

LSDV感染反刍动物，对人类没有感染性。它是一种影响牛以及水牛的病毒性疾病，某些品种的牛比其他品种更容易感染，特别是薄皮的牛，如泽西岛和根西岛的牛品种和埃塞俄比亚的福格拉牛[2]，以及非洲桑加牛。也有研究表明LSDV可以感染一些非洲的其他野生动物[5]，已经证明LSDV可以通过实验感染长颈鹿、黑斑羚和阿拉伯牛津鱼[16]。然而，尚未见报道有任何野生动物的LSD暴发。这些研究表明，野生动物在LSDV的传播中没有发挥重要作用。然而，由于受感染动物的死亡和被捕食，可能会导致其余种群中存在少量的血清阳性，这种潜在的危害尚不清楚[2]。像SPPV和GTPV一样，LSDV对上皮细胞具有易感性。

3 临床症状

LSD的发病率差异很大，在3%～85%之间。在流行地区，发病率约为10%。LSD的死亡率在1%～3%之间，但在严重的暴发情况下高达40%。这些发病率和死亡率的不同很可能和牛的品种、健康状况、病毒分离毒株和参与传播的昆虫媒介的不同有关。感染LSDV后死亡的具体原因目前尚不清楚，但与许多因素有关，包括牛的品种、病毒毒株、继发性细菌感染、动物的健康状况以及参与传播的昆虫媒介的类型；另一个因素是由副痘病毒引起的伪牛痘和牛结节性皮肤病的混淆[17]。

LSD会出现至少5处典型病变，特征是发热、淋巴结病、皮肤结节和眼鼻分泌物黏稠增多，皮肤损伤通常表现为乳头上的痘损伤，也可能在其他部位引起皮肤损伤，此外全身出现0.5～5.0 cm大小的坚实平顶丘疹和结节，如会阴、大腿、颈部、臀部、阴囊、颊黏膜和头部内侧[12]。如果该症状伴有发热(高于39.5 ℃)或产奶量减少20%，则定义为严重病例。LSD最明显的临床症状是形成全身的皮肤病变，这些皮肤损伤愈合后会留下永久损伤的疤痕。

4 实验室诊断

4.1 传统实验室方法

虽然LSDV会引起明显的皮肤和内脏病变，但仍需要实验室确诊。经典的方法如电子显微镜，可以用来识别皮肤病变中的痘病毒，然而除非应用特异性抗体免疫染色方法，电子显微镜并不能区分SPPV、GTPV和LSDV这3种毒株。

通过病毒的分离盲传可以在细胞或鸡胚上观察到病变从而进行诊断。皮肤结痂以及鼻腔和口腔拭子是病毒分离最有效的样本[27]。牛结节性皮肤病的病毒分离一般有2种方式：一是利用鸡胚培养，病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上增殖，但鸡胚不死亡，接种5日龄的鸡胚随后置33.5℃孵育，6 d后收毒；另一个比较常用的方式是利用细胞分离。目前，初级羊肾或原羊睾丸细胞是最常用的分离细胞，然而，原代细胞最明显的缺点是需要不断地建立新的培养物来避免细胞批次变异和外来物质的污染。因此，相应的细胞系是更为方便的选择。目前幼羔羊睾丸细胞系(OA3.Ts)[28]和牛肾细胞(MDBK)[29]已被评估为原代细胞的替代品。有研究显示该病毒可以在许多其他细胞培养物上生长，如犊牛和羔羊的肾上腺和甲状腺等原代细胞，以及仓鼠肾细胞(BHK-21)和非洲绿猴肾细胞(Vero)[30]等。LSDV的细胞病变产生较慢，通常在10 d后才能看到细胞病变，盲传5代后可以用特异的荧光抗体观察到细胞内出现胞浆内包涵体。已经适应于细胞培养物内生长的病毒，可在接种后24～48 h内使细胞培养物内出现长梭形细胞，并且细胞聚集生长并且成团，经过反复冻融离心后可收毒。然而，这种方法耗时长，需要一定的实验条件和专业人员，且并不能对病毒做出鉴别诊断，因此难以推广。

4.2 免疫学方法

通过诱导不同细胞斑块的形成，抗山羊痘病毒血清免疫染色可诊断出山羊痘病毒，其具有以细胞拉长为特征的细胞病变效应，但不能区分LSDV、SPPV和GTPV这3种病毒。目前测定山羊痘病毒抗体的金标准是病毒中和试验，然而这种方法虽然能有效检测病毒抗体，但它速度慢，耗人力且需要活的病毒，这在无病原国家通常是不合适的。在拥有特异性抗体的情况下，免疫印迹方法(Western blot)具更高的特异性和敏感性，然而这种方法需要熟练的抗体制备技术，在基层无法推广。使用灭活山羊痘病毒可以作为ELISA抗原，但是在常规诊断实验室是不切实际的，因为病毒培养需要严格的生物控制设施。

4.3 分子学方法

聚合酶链反应(PCR)和实时PCR检测(qPCR)是检测山羊痘病毒基因组快速而敏感的诊断技术。实验室可以从结痂组织均质上清液、抗凝血液或冷冻牛精液中提取基因组DNA(有研究发现在患病牛鼻冲洗液中也出现了少量病毒[18])，裂解后用洗脱缓冲液洗脱，紫外分光光度计检查DNA浓度，并将DNA储存在-20 ℃中备用。

PCR检测方法比抗原捕获ELISA方法具有更高的敏感性，且不需要特异性抗体，降低了经济成本。早在1998年Ireland就通过包膜蛋白(LSDV074)的引物成功检测到了病毒[19]，之后该方法成为多种检测方法的衡量标准。然而山羊痘病毒属的3种病毒相似度太高，无法通过普通PCR方法进行区分。

qPCR的优点在于更敏感并允许量化，还避免了在识别LSDV基因组时出现交叉污染的风险，降低了假阳性的概率[18]。RPO30 (RNA聚合酶亚基)[20]、P32和GPCR 在山羊痘病毒属中高度保守，可以用来识别山羊痘病毒分离株。P32抗原是一种存在于所有山羊痘病毒中的结构蛋白，含有主要的抗原决定簇，其编码的包膜蛋白与牛痘病毒H3L基因编码的P35蛋白同源，并定位于成熟的细胞内病毒颗粒的膜表面。GPCR基因编码1个与G蛋白偶联趋化因子受体亚家族相关的蛋白。该蛋白具有G蛋白偶联趋化因子受体超家族的关键结构特征，如7个疏水区域和第一、第二细胞外环中的半胱氨酸残基。由于疫苗LSDV株中存在一个27 bp的缺失(LSDV126)[21]，可用于野生型LSDV的特异性检测[22]，而SPPV和GTPV在其同源EEV序列中也出现了这27 bp的缺失，所以该区域也可以用于针对绵羊、山羊或牛病毒分离株的特异性分析[23]。

其他常用的生化检测方法还包括基因测序、变性高效液相色谱技术(HRM)和环介导等温核酸扩增技术(LAMP)。通过LSDV中保守序列测序，进行基因比对和系统进化树分析，可以找到病毒来源和相似性，为流行病学调查提供指导和方向[24]。HRM指可以采用高分辨率熔化分析DNA片段进行PCR扩增，以检测病毒[25]，目前这项技术还没有用于LSDV检测。由于高度依赖DNA的质量和浓度，该方法无法在常规诊断中使用。LAMP是一种简单、特异性和成本效益高的方法，其诊断精度与PCR相似[26]。

5 疫苗研发

目前的疫苗开发主要侧重于减毒活疫苗的生产。减毒活疫苗主要可分为异源减毒活疫苗和同源减毒活疫苗。由于SPPV、GTPV和LSDV同属于山羊痘病毒属，且有交叉保护性[31]，所以山羊痘疫苗和绵羊痘疫苗都能用来预防控制牛结节性皮肤病的传播。山羊痘减毒活疫苗属于LSD的异源减毒活疫苗，对于LSD的免疫接种，目前我国推荐使用5倍剂量的山羊痘疫苗用于预防 LSD[32]。在非洲和中东，有几种异源减毒活疫苗目前被用于牛和小反刍动物接种，如罗马尼亚(Romania)和南斯拉夫RM-65毒株(SPPV)以及Gorgan和Mysore毒株(GTPV)，虽然在一定程度上避免了在牛上产生的副作用，但却只能提供部分交叉保护[33]。

国外常用的疫苗是同源减毒株，如KSGPO-180、KSGPO-240和南非Neethling毒株 (LSDV)[34]，其中Neething毒株已成功使用几十年，但在俄罗斯发现几种类似疫苗的重组菌株后，它们的安全性最近受到了质疑。2016年哈萨克斯坦暴发LSD，该国大规模地实施Lumpivax疫苗接种，此疫苗后来被发现是由3种不同毒株重组而成[33]，对其他国家如中国、越南的致病毒株出现埋下了隐患。世界动物卫生组织(WOAH)建议在引入一种通常不用于牛的疫苗株之前，需要使用最敏感的品种(山羊或绵羊)进行对照试验，因为山羊痘属病毒疫苗株可在一些牛的接种部位产生较大的局部反应，除此之外LSDV疫苗接种提供的保护持续时间尚不清楚。由于这些因素的不确定性，导致一些畜主不愿意冒险打疫苗，从而阻碍了疫苗的推广使用，然而LSD暴发会导致严重的经济损失，所以更为安全有效的疫苗研发是十分必要的。

基因改造减毒活疫苗是未来应对疫病暴发的重要方向。与其他痘病毒一样，LSDV 基因组编码大量的免疫调节基因，通过基因工程方法删除或插入这些基因可构建减毒活疫苗毒株[31]。

LSDV基因组中存在9个在SPPV和GTPV中不存在的基因，这是SPPV和GTPV因进化而丢失的基因，可能是LSDV感染牛的原因之一。这9个基因分别是LSDV特异性基因(LSDV132)、IL-1受体(IL-1R)(LSDV013)、LSDV002、LSDV155、LSDV004、LSDV153、LSDV009、LSDV026和LSDV136。这9个基因里有2个已经预测了其功能，第一个是位于ORF_013的IL-1样受体，其作用是作为IL-1受体的诱饵来发生免疫逃避；第二个是位于ORF_026的F11L，已有研究证明其可以通过抑制Rho信号和破坏皮层肌动蛋白层在促进病毒逃逸中发挥作用[35]。除此之外的7个基因目前已经有人在进行相关研究。聂福平[6]已对ORF132进行功能预测并成功构建表达载体，为新型疫苗的研制奠定基础。当黏液瘤病毒(也缺乏F11L同源物)被插入痘苗病毒中的F11L时，病毒的繁殖和体内外的传播能力均得到增强[36]。ORF_009类似于痘苗病毒N2L的C末端结构域(25%～30%蛋白质序列标识)，这是一种可以编码IRF3抑制剂的基因[37]。目前对于这些毒力基因的研究还不透彻，需要进一步研究。

LSDV中的保守基因可以作为基因突变缺失的目标位点。胸苷激酶(TK)基因是山羊痘病毒属病毒复制的非必需基因，缺失TK基因的GTPV突变株在神经细胞中的复制能力大为减弱，使疫苗株更加安全[38]。对LSDV的TK基因研究表明，与许多痘病毒一样，TK活性对LSDV的生长很重要，该基因可以用作重组疫苗的插入位点[39]。由于痘病毒基因组大，减毒的LSDV还可以作为重组疫苗载体，与其他病毒疫苗形成二联苗。

在LSDV基因组中还存在一些疫苗相关突变基因位点，如ORF_134，ORF_144，ORF_145和RF_019。其中ORF_134基因编码的蛋白质与B22R(变异体)超家族C端有32%的相似性，而猴痘病毒B22R超家族中的MPXV197蛋白可抑制T细胞反应，增加病毒毒力[40]。ORF_144可能是牛痘病毒VV-Cop-A55R的同源物，编码BTB/POZ结构域，cullin结合位点和4个C端kelch重复。有研究显示所有的LDSV疫苗株的ORF_144位点上都存在+1的移码突变(在S256处的T2至T3处)[5]。ORF_145则很可能是VV-Cop-B4R的同源物，编码4个锚蛋白重复序列和1个C端PRANC/F盒结构域。这些牛痘病毒基因通常是通过kelch和锚蛋白介导的相互作用来促进病毒和宿主蛋白的泛素化和降解[41]。ORF_019可以编码第二个类似于ORF_144的BTB/kelch蛋白，可能是VV-Cop-F3L的同源物，在有些LSDV疫苗中也观察到了ORF_019的失活。

Erster等[42]对LSDV126基因和全病毒基因组序列进行系统发育分析，发现LSDV分离株形成了强毒和疫苗毒两类。在这项分析中，所有缺乏快速感染牛能力的痘病毒只携带1个27 bp片段的拷贝，这表明LSDV126基因在痘病毒感染牛的能力上发挥着重要作用。研究还发现LSDV126形成的糖蛋白——VYDLPPND二聚体，被预测为1个抗原表位，而疫苗株中则没有。这种表位的缺失可能有助于降低疫苗的传染性，同时保留其在接种动物中诱导免疫状态的能力。目前国内已有研究针对LSDV126发展出特异性探针来进行鉴别诊断[22]，但是对于其免疫学特征还没有进展，这可能是未来疫苗研究的一个方向。

此外，4种LSDV疫苗LW1959、Herbivac、OBP和Cro2016都出现了ORF_087和ORF_131的缺失。在这些分离株中，ORF_087编码了一种可能由于缺失约50个氨基酸而无明显作用的蛋白[43]，它可能就是LSDV中晚期表达基因(VVCOPD10R)的同源基因，可以编码2种山羊痘病毒属突变蛋白之一，从而催化mRNA分解。ORF_131可以编码一种在催化上不具活性的痘病毒过氧化锌歧化酶的同源物，该蛋白的同源物可以调节超氧化物信号，也是影响病毒热应力敏感性的主要病毒衣壳成分[44-45]，已有研究表明SOD同源物可能提高免疫原性并降低毒力[46]。

值得注意的是，LSDV中国毒株(LSDV/China/Xinjiang/2019)被推测为疫苗样毒株[47]，提示目前在国内流行的病毒很有可能是疫苗株与自然毒重组衍生形成的，这种复杂性不仅给国内的牛结节性皮肤病疫情防控带来了难题，也为疫苗的研制带来了难题，如何有效检出病毒以及研发出安全有效的疫苗是目前的研究热点。

6 小结

目前，WOAH将牛结节性皮肤病列为法定报告的动物疫病，我国农业农村部暂时将其作为二类动物疫病管理。牛结节性皮肤病的有效防控需要了解其直接或间接的传播方式以及各种节肢动物的媒介作用，做好蚊、蝇、蠓、虻、蜱等虫媒的灭杀工作，并对隔离场所内外环境进行严格消毒。必要时采取封锁、扑杀等措施。按照动物防疫法和农业农村部规定，对牛结节性皮肤病疫情实行快报制度。任何单位和个人发现牛出现疑似牛结节性皮肤病症状，应立即向所在地畜牧兽医主管部门、动物卫生监督机构或动物疫病预防控制机构报告，有关单位接到报告后应立即按规定通报信息，按照“可疑疫情—疑似疫情—确诊疫情”的程序认定疫情。

除此之外，我们还需要开发出一种快速确认的诊断方法，探究当前使用的疫苗的有效性，了解疫苗保护的免疫学相关性，开发出新型、安全、高效和性价比高的动物疫苗，包括灭活疫苗和潜在的重组疫苗，同时加强对各级畜牧兽医主管部门、动物疫病预防控制中心和动物卫生监督机构工作人员的技术培训，提高从业人员防治意识[48]。