静磁场暴露对大鼠抑郁样行为及海马DR2和DAT表达的影响

唐 硕， 叶雨萌， 王雪佳， 杨蕾蕾， 张 潇，王少霞， 郝延辉， 左红艳， 李 杨

(1.军事科学院 军事医学研究院 辐射医学研究所， 北京 100850；2. 32311部队， 北京 102112)

0 引言

磁场按其频率可分为静磁场和动磁场，按其强度可分为弱磁场(<1 mT)、中强度磁场(1 mT～1 T)、强磁场(1 T～5 T)和超强磁场(>5 T)[1]。流行病学调查及动物实验研究均表明，脑是磁场暴露损伤的主要敏感靶器官[2]，磁场对神经系统的影响最为显著，具体表现在认知功能损伤[3]、情绪行为异常[4]、脑电[5]及脑组织病理改变[6]几个方面。脑内多巴胺(Dopamine，DA)能系统与情绪调控密切相关，DA是中枢神经系统中最重要的儿茶酚胺类神经递质之一，在中枢参与学习记忆、奖赏、运动、情绪等多种大脑重要生理功能的调控[7]。多巴胺转运体(Dopamine transporters，DAT)通过重摄取突触间隙内DA，实现了对突触间隙内DA浓度的调控，DAT在多巴胺能神经系统中发挥着纽带作用，通过对突触间隙内DA浓度的调节，使其与多巴胺受体(Dopamine receptor，DR)结合后实现各种生理功能[8]。

磁场暴露对于DAT和DR的影响及其机制尚不明确，需进一步深入研究。本研究通过对不同强度静磁场暴露后的大鼠行为、脑电图检测用来探讨静磁场暴露对大鼠抑郁样行为及脑电的影响，进而采用免疫组织化学法检测大鼠海马DAT及DR2的表达变化，以期初步探究静磁场暴露影响大鼠行为学的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级雄性Wistar大鼠60只，体重200±20 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，随机分为4组，即对照组(C组)15只，磁场暴露低强度组(50 mT、L组)15只，磁场暴露中强度组(100 mT、M组)15只，磁场暴露高强度组(200 mT、H组)15只。其中每组10只用于糖水偏爱实验，另外5只用于脑电生理及取材。

1.2 暴露方法

将大鼠置于自制的有机鼠笼中，采用超导磁体暴露源进行全身暴露，暴露强度为50 mT、100 mT、200 mT，时间为1 h/d，连续暴露15 d或30 d。对照组置于相同环境进行假暴露。

1.3 糖水偏爱指数检测

磁场暴露前，将各组大鼠饲养于安静的房间，每组10只。每个鼠笼放置两个水瓶，均装有1%蔗糖水喂养24 h，再将水瓶更换为1%蔗糖水和普通水，喂养24 h，将两个水瓶取走，禁水禁食24 h。同时给予每只大鼠事先称重好的1%蔗糖水和纯水各1瓶，60 min后测量每只大鼠糖水消耗量和液体消耗总量。于暴露第15 d、30 d和终止暴露后第7 d，重复以上实验步骤，分别测量以上时间点各组大鼠糖水摄入量和液体摄入总量，而后计算糖水偏爱指数，糖水偏爱指数=糖水摄入量/(糖水摄入量+普通水摄入量)。

1.4 脑电图检测

每组随机选取5只大鼠分别于暴露前、暴露第1 d、第5 d、第10 d、第15 d 进行脑电生理检测。操作流程为：首先，根据体重腹腔注射1%戊巴比妥钠0.5 ml/100 g麻醉大鼠，而后剃刀脱毛，酒精棉球去脂，使每个电极电阻均小于12 kΩ。取两眼外眦与外耳门连线的前中1/3交点处做一连线，并在此连线中点旁开1 mm处(相当于冠状缝后矢状缝旁开1 mm)头皮下安置电极针，耳缘部安置对照电极。采用MP-150多导生理记录及分析系统对大鼠脑电图(ECG)进行检测，连续记录3 min脑电图。然后进行脑电图波形及功率谱分析。

1.5 大鼠海马组织取材及石蜡切片制备

每组5只大鼠根据体重腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后，取大鼠全脑，经4%甲醛液固定2周，根据大鼠脑区图谱定位海马位置，并将所取区域切成形状规则、厚度为3 mm大小的组织块，放入包埋盒中，用流水冲洗12 h，去除固定物和沉淀。 然后将包埋块放入自动脱水机中，按照程序脱水后，置于60℃石蜡中2 h，取出后进行包埋及石蜡切片制备。

1.6 免疫组织化学检测大鼠海马DAT、DR2的表达和图像定量分析

首先石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水冲洗；使用微波炉加热柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，自然冷却至室温；PBS洗3 min ×3次；在切片上滴加内源性过氧化物酶阻断剂覆盖组织，室温避光10 min孵育，PBS洗3 min ×3次；滴加DAT (兔源，ab184451，abcam，1∶200)及DR2 (兔源，ab85367，abcam，1∶200)一抗，于4℃过夜；后滴加酶标山羊抗兔IgG聚合物，37℃孵育30 min，PBS洗3 min×3次；在显微镜下控制DAB显色时间，出现浅棕色阳性信号时即可终止显色；后使用苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水返蓝；脱水、透明、封片及图像采集后，采用Image J进行积分光密度及阳性细胞数定量分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 200 mT静磁场暴露致大鼠出现抑郁样行为

200 mT静磁场暴露第15 d，200 mT 大鼠糖水偏爱指数较C组无明显差异；暴露第30 d，与C组比较，200 mT 大鼠糖水偏爱指数显著降低，且较暴露前显著降低；暴露终止后7 d，200 mT 糖水偏爱指数较C组无显著性差异，如图1所示。

图1 200 mT静磁场暴露不同时间对大鼠糖水偏爱指数的影响H组与C组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01，组内各时间点与暴露前比较，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

2.2 200 mT静磁场暴露致大鼠脑电呈抑制状态

静磁场暴露第5 d，与C组比较，H组大鼠脑电波出现了高幅慢波，提示δ和θ波增多，抑制增加。暴露第15 d，H组大鼠脑β波和θ波功率相对功率值显著降低；暴露第10 d、15 d，H组δ波相对功率值功率较C组显著升高，重心频率F显著降低。L和M组大鼠脑电图较C组无显著差异，如图2和表1所示。

表1 不同强度静磁场暴露不同时间大鼠δ、θ、β、α频段相对功率值和重心频率F的变化(n=5，¯

图2 不同强度静磁场在暴露不同时间对大鼠脑电图的影响

2.3 静磁场暴露致大鼠海马组织DAT和DR2表达发生改变

静磁场暴露第1 d、5 d和10 d，各强度组与C组比较大鼠海马DR2表达无明显变化；暴露第15 d，各强度组大鼠海马DR2表达与C组比较明显降低，阳性细胞数量减少，其中H组减少最为显著，如图3所示。

图3 不同强度静磁场暴露不同时间大鼠海马DR2表达变化(免疫组化SP法，Scale bar=50 μm)A：暴露第15 d C组；B：暴露第15 d L组；C：暴露第15 d M组；D：暴露第15 d H组，不同时间点各强度组与C组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

静磁场暴露第1d和5d，各强度组大鼠海马DAT表达与C组比较无明显差异。暴露后大鼠海马DAT表达发生变化，免疫组化结果如图4所示，静磁场暴露第10d，M组和H组大鼠海马神经元DAT表达与C组比较明显升高，阳性细胞数量增加，L组与C组比较无明显差异。暴露第15d，各强度组大鼠海马神经元DAT表达与C组比较显著升高，阳性细胞数量明显增加，如图4所示。

图4 不同强度静磁场暴露不同时间大鼠海马DAT表达变化(免疫组化SP法，Scale bar=50 μm)A：暴露第15 d C组；B：暴露第15 d L组；C：暴露第15 d M组；D：暴露第15 d H组，同时间点各强度组与C组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

3 讨论

磁场暴露对大鼠行为学影响的实验研究显示，3 Hz，600 V/m电磁场暴露可以使大鼠自发活动时间减少，动物的情绪反应低落，多处于焦虑状态。而10 Hz，600 V/m电磁场可以使大鼠的自发活动时间增加，大鼠可以表现为积极和活跃的情绪反应[9]。脉冲磁场连续暴露3个月后，旷场实验分析结果显示大鼠自发活动明显增多[10]。可见，不同参数的磁场对大鼠自发探索活动会产生不同的影响。当前磁场暴露对抑郁情绪影响的实验究较少，Kitaoka[11]等对小鼠进行3mT的极低频磁场暴露，累计暴露时间200 h，结果发现可诱发小鼠产生抑郁样行为。本文通过糖水偏爱试验检测静磁场暴露是否导致大鼠抑郁样行为。糖水偏爱是评价抑郁动物对奖赏的快感消失和敏感缺乏的金标准，本研究发现，200 mT静磁场暴露15 d后大鼠糖水偏爱指数无显著变化，延长暴露至30 d，大鼠出现了抑郁样行为，暴露终止后7 d大鼠恢复对糖水的偏爱，表明在一定条件下，静磁场长期暴露可导致大鼠出现抑郁样行为，暴露终止后，抑郁样行为消失。

大脑皮层电生理活动主要包括α、β、θ和δ4种主要脑电波节律。不同节律的脑电波反映了不同的认知功能、行为记忆、思维状态和神经功能状态。一般认为，α和β低幅快波是大脑皮层兴奋时的主要波形，反映大脑皮层神经元兴奋的程度，δ和θ高幅慢波是大脑皮层处于抑制状态时的主要表现，反映了大脑皮层神经元抑制的程度，受抑制程度增加，兴奋程度降低[12]。正常状态下大鼠脑电以高频低幅波为主，当大脑皮层受到抑制的程度增加时，脑电中高频波段减少低频波段增加，并随着抑制程度的逐渐增强，脑电信号整个电功率频谱会向低频率迁移，致使重心频率整体降低，降低程度与大脑皮层受到的抑制程度呈正相关。徐新萍等[13]将大鼠暴露于50 Hz，400 μT磁场中，连续暴露60 d，研究结果显示暴露终止后6 h，磁场暴露组大鼠出现δ频段相对功率值呈升高改变，而β频段相对功率值降低。可见极低频电磁场暴露可使大鼠脑电图功率谱分布异常。苏建云等[9]研究发现，大鼠暴露于不同频率的电磁场环境中，大鼠的海马CA1区脑电能量信号谱发生的改变，最为显著性的结果是大鼠海马CA1区在磁场暴露后θ波频段能量显著降低，而且使脑电低频成分中的能量显著增加。本文研究发现，200 mT静磁场暴露导致大鼠脑电波出现了高幅慢波，抑制增加，且β波和θ波功率相对功率值显著降低，表明一定条件静磁场暴露可导致大鼠大脑皮层更多处于抑制状态，兴奋性降低，并随暴露强度的增加，抑制效果更为明显，可能与其抑郁样行为具有相关性。

多巴胺能神经系统功能异常与抑郁的发生存在密切的关联[7]。研究表明，DR表达变化在抑郁发生发展中发挥了重要的作用[14]。DR属于7次跨膜的G蛋白耦联受体家族，该受体分为5个亚型，其中DR2是DR家族中含量第二的受体亚型，主要分布于纹状体、海马、伏隔核和嗅结节[15]，其主要表达于DA能神经元细胞膜。研究认为，DR2异常与抑郁相关。目前抑郁患者脑区DR2表达变化报道不尽一致，有研究报道首发抑郁症患者纹状体DR2总体结合力降低[16]。M Pecina等[17]的研究通过PET检测到抑郁患者腹侧纹状体有异常高的DR2表达。而在另一项对抑郁动物模型的研究中发现，腹侧纹状体DR2表达降低，数量减少，并在抑郁症状得到治疗后恢复[18]。20 Hz，14 mT极低频磁场暴露后大鼠背侧海马神经元DR2密度降低[19]。另有研究报道20 Hz，14 mT极低频磁场暴露后，使吗啡依赖大鼠海马CA2区DR2表达降低更为明显[20]。本文研究发现不同强度静磁场暴露15 d，各个强度组大鼠海马组织中DR2均降低，其中H组降低更为显著。提示静磁场暴露所致大鼠海马DR2表达降低可能与大鼠抑郁样行为相关，且分子表达的改变早于行为学改变。

DAT是一个12跨膜蛋白，仅表达于DA能神经元中，其在黑质、海马、纹状体和伏隔核区域神经元中大量表达，DAT位于突触前体，其功能是将突触出间隙的DA重摄取，维持DA在突触间隙一定浓度，使DA与DR结合后激活下游一系列信号通路产生生物效应[8]。本研究发现，一定条件静磁场暴露后大鼠海马DAT表达升高，进而对突触间隙多巴胺重摄取作用增强，使突触间隙内DA含量降低，可能与静磁场暴露后大鼠抑郁样行为相关。

综上，在一定条件下静磁场暴露导致脑电图和DA系统异常，可能为静磁场暴露引起大鼠抑郁样行为的机制之一。