乳腺浸润性癌中EZH2定量表达和M2型巨噬细胞相关性及与临床病理特征的关系

方会娟， 徐小艳， 徐宪伟， 姜 黄

(河南中医药大学 第五临床医学院(郑州人民医院)病理科， 河南 郑州 450000)

0 引言

在过去20年中，我国乳腺癌的发病率和死亡率呈快速上升趋势，虽然手术、放化疗、免疫治疗和联合治疗等手段大大提高了乳腺癌患者的生活质量，但对于总生存率仍无明显改善，乳腺癌依然严重威胁着女性群体的健康，侵袭和转移是乳腺癌患者病情复发和死亡的主要原因。研究表明，在包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤细胞中存在 EZH2(enhancer of zeste homolog 2)基因的突变及异常表达，与癌症的侵袭、转移及不良预后密切相关[1]。肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是肿瘤微环境极为重要的成分，在肿瘤微环境中巨噬细胞可以被极化成两种不同的亚型[2]：经典活化的M1型巨噬细胞和替代活化的M2型巨噬细胞，TAMs主要为M2型巨噬细胞，乳腺癌的不良预后与TAMs 的浸润密切相关[3]。CD163 是公认的M2型巨噬细胞表面标志物之一。乳腺浸润性癌中EZH2定量表达特点如何，其与CD163 是否存在相关性，这些都尚未见文献报道。为了解乳腺浸润性癌中EZH2和CD163与多个临床病理因素的关系及二者之间的相关性，本研究采用免疫组织化学方法检测67例乳腺浸润性癌及相应的癌旁组织中EZH2蛋白的表达情况，采用定量测试方法，测试EZH2蛋白的阳性单位(Positive Unit，PU)，计数高倍视野CD163的个数，分析EZH2蛋白定量表达和CD163数目与乳腺浸润性癌的临床病理特征的关系及二者的相关性，旨在观察EZH2和CD163是否参与乳腺浸润性癌的侵袭和转移过程，以拓展和丰富人们对乳腺癌发生和发展机制的认识。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集河南中医药大学人民医院病理科2015年1月至2017年12月期间的手术切除的活检标本，其中包括乳腺浸润性癌67例和相应的67例癌旁组织。67例乳腺浸润性癌标准如下：①患者均为女性；②术前均未接受放化疗或中医治疗；③经过乳腺保乳或者乳腺根治性切除术。收集患者相关临床资料，按照2019年WHO乳腺癌组织病理分级分类法，即核分裂象、腺管形成和细胞异型性对其进行分级。所有标本均经10%的中性福尔马林固定，石蜡包埋，并经河南中医药大学人民医院病理科诊断确诊。

1.2 主要试剂

EZH2一抗兔抗人单克隆抗体公司购自福州迈新公司、CD163一抗兔抗人单克隆抗体、二抗及二氨基联苯胺(DAB)均为河南赛诺特生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色

(1)3～4 μm石蜡切片、烤片、脱蜡及水化；

(2)抗原修复，EZH2采用EDTA修复，CD163采用柠檬酸修复；

(3)一抗37℃孵育1.5～2 h；

(4)二抗室温孵育20～30 min；

(5)DAB显色3～5 min；

(6)脱水、透明及中性树胶封片。

EZH2阳性对照采用已知EZH2阳性的乳腺癌组织和PBS代替一抗分别作为阳性和空白对照，CD163阳性对照采用扁桃体和和PBS代替一抗分别作为阳性和空白对照。

1.4 EZH2免疫组化定量测试

根据空白对照、乳腺癌组织自身阴性对照、阳性对照的显色情况，在确保无假阴性和假阳性的前提下，以EZH2细胞核染成棕褐色为阳性。用ImagePro Plus图像分析软件，测试其阳性单位值(Positive Unit，PU)[4]。方法如下：在40倍物镜下，从每例切片中取10个着色最强的视野输入计算机，使其转换成灰色照片，将照片导入ImagePro Plus图像分析软件。测试每个阳性细胞的灰度Gα，同时在相应的10个视野中测试背景灰度Gβ并取其平均值。本研究中测试软件设定的Gmax为256，按下列公式计算每个阳性细胞的阳性单位(Positive Unit)PU值[4]。

1.5 CD163计数判读

在低倍镜下选取视野中巨噬细胞最密集的5个区域，在高倍镜下(400 ×)计数，取5个视野总和的平均值进行统计。

1.6 统计学方法

用SPSS 22.0软件进行统计学分析。两个独立样本均数间比较采用t检验。多样本均数之间采用方差分析进行比较。若方差齐，组间多重比较采用LSD检验，若方差不齐，组间多重比较采用Dunnett’S T3检验。相关分析采用Spearman分析法。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EZH2和CD163蛋白在乳腺癌旁组织和浸润性癌中表达情况

EZH2阳性表达部位定位于乳腺癌细胞核，在乳腺间质的纤维细胞中未见表达，在乳腺癌癌旁组织中有少量弱表达。EZH2蛋白PU值在乳腺癌组织(14.81±5.62)中显著高于其在癌旁组织(3.88±1.33)中的表达，差异具有统计学意义(P=0.000)。如图1和表1所示。

表1 EZH2和CD163蛋白在乳腺癌旁组织和浸润性癌中表达情况

图1 EZH2和CD163蛋白在乳腺癌旁组织和浸润性癌中的表达A：EZH2在癌旁组织中的表达；B：EZH2在乳腺癌组织中的表达；C：CD163在癌旁组织中的表达；D：CD163在乳腺癌组织中的表达。免疫组织化学法(200倍，视野直径约1.1 mm)

CD163阳性表达部位主要定位于乳腺癌癌巢周围组织间隙的组织细胞内，染色呈棕黄色颗粒，呈小巢状分布，也有散在分布于乳腺癌癌巢组织内。CD163计数在乳腺癌组织(148.10±55.62)中显著高于其在癌旁组织(7.34±3.57)，差异具有统计学意义(P=0.000)(如图1、图2和表1所示)。

图2 组织细胞在乳腺癌中的分布A：大部分组织细胞位于癌巢周围呈片状分布(200倍镜，视野直径约1.1 mm)；B：少量组织细胞散在分布于癌巢内(400倍镜，视野直径约0.55 mm)

2.2 EZH2和CD163与乳腺浸润性癌临床病理特征的关系

乳腺浸润性癌中，EZH2与肿瘤直径大小相关，其蛋白PU值在肿瘤直径≤2 cm、2～5 cm和>5 cm中表达依次升高，分别为12.11±4.18、18.24±4.80、19.14±5.41，差异总体有统计学意义(P=0.000)，但其在2～5 cm和>5 cm组中，差异不具有统计学意义(P>0.05)；EZH2与乳腺癌WHO分级有关，其在WHOI级、II级、III级中的PU值表达依次升高，分别为11.16±6.66、13.59±4.28、18.75±5.47，差异具有统计学意义(P=0.000)；EZH2在淋巴结有转移组别(19.35±4.52)中高于无淋巴结转移组别(10.66±2.38)，差异有统计学意义(P=0.000)；EZH2在TNMⅢ-Ⅳ期(16.68±5.92)表达高于Ⅰ-Ⅱ期(11.86±3.57)，差异有统计学意义(P=0.000)；EZH2在ER阳性组中(11.68±3.83)低于ER阴性组(16.34±5.76)，差异有统计学意义(P=0.000)；EZH2在PR阳性组中(12.51±4.57)低于ER阴性组(16.09±5.79)，差异有统计学意义(P=0.000)；EZH2与患者的年龄、肿瘤的部位和Her-2是否扩增均无关(P>0.05)。见表2。

表2 EZH2和CD163 与乳腺癌临床病理特征的关系

CD163计数与肿瘤直径大小相关，其数目在肿瘤直径≤2 cm、2～5 cm和>5 cm中表达依次增多，分别为121.38±41.54、181.80±47.31、191.18±53.20，差异总体有统计学意义(P=0.000)，但其在2～5 cm和>5 cm组中，差异不具有统计学意义(P>0.05)；CD163计数与乳腺癌WHO分级有关，其在WHO I级、II级、III级中的计数依次升高，分别为110.56±67.04、136.66±42.30、186.75±53.57，差异具有统计学意义(P=0.000)；CD163计数在淋巴结有转移组别(192.78±45.13)中高于无淋巴结转移组别(107.26±23.50)，差异有统计学意义P=0.000)；CD163计数在TNMⅢ-Ⅳ期(166.15±59.10)高于Ⅰ-Ⅱ期(117.50±36.86)，差异有统计学意义(P=0.000)；CD163计数在ER阳性组中(125.50±44.63)低于ER阴性组(163.07±57.40)，差异有统计学意义(P=0.000)；CD163计数在PR阳性组中(125.50±44.63)低于ER阴性组(160.72±57.58)，差异有统计学意义(P=0.000)；CD163计数与患者的年龄、肿瘤的部位和Her-2是否扩增均无关(P>0.05)。见表2。

2.3 乳腺浸润性癌中EZH2和CD163表达的相关性

Spearman相关性分析显示：67例乳腺浸润性导管癌中，EZH2和CD163蛋白表达呈显著正相关(RS=0.990，P=0.000)，即EZH2蛋白表达量越高，CD163数目相应的越多。

3 讨论

EZH2在多种恶性肿瘤细胞中表达异常，这些异常导致了抑癌基因的沉默，与肿瘤的侵袭转移及不良预后有密切关系。已有的研究表明，其在胶质瘤、前列腺癌和卵巢癌等肿瘤中的表达与肿瘤的发生和发展密切相关[5-7]，其高表达提示肿瘤的不良预后。赵昕辉等[8]利用整合生物信息学手段分析结果表明，EZH2在乳腺癌组织中的mRNA及蛋白表达量显著高于正常乳腺组织，EZH2的表达水平与年龄、分期及分子分型密切相关，乳腺癌患者EZH2表达水平高的总生存期、无病生存期、无远处转移生存期及后进展生存期均明显低于EZH2低表达患者。Zhang L等[9]研究表明，EZH2通过整合素β1-FAK激活参与TGFβ信号传导促进乳腺癌症骨转移。本研究采用免疫组织化学方法结合图像定量测试分析表明EZH2蛋白在乳腺浸润性癌中阳性强度高于癌旁组织，其在乳腺浸润性癌的WHO Ⅲ级、淋巴结有转移及TNM分期Ⅲ-Ⅳ表达量较高，EZH2蛋白定量表达与激素受体相关，在ER、PR阴性这表达较高，提示该蛋白在乳腺癌侵袭和进展的过程中发挥了重要的作用。EZH2蛋白定量研究结果与以往文献定性结果基本相似。本研究结果还发现，EZH2蛋白定量表达与乳腺癌的肿瘤直径有关，其在肿瘤直径≤2 cm、2～5 cm和>5 cm中表达依次升高，差异总体具有统计学意义，但是其在2～5 cm和>5 cm中表达基本相似，分析原因可能跟样本含量有关。本研究结果显示，EZH2蛋白定量表达与患者年龄无关，与以往文献报道[8]不同。其原因为：①免疫组化判读方法不一致，本研究采用了定量判读的方法；②年龄分组的界限不一致；③样本量不一致。本研究结果提示，EZH2的表达可能与乳腺癌的进展和不良预后相关。

M2型巨噬细胞参与Th2型免疫反应，抑制抗肿瘤免疫，对肿瘤细胞杀伤活性降低。研究表明，M2型巨噬细胞在多种肿瘤中可促进肿瘤的浸润和转移，在头颈部鳞癌中研究发现M2型巨噬细胞高表达组织与肿瘤多灶性、浸润深度及发病次数呈显著正相关[10]。Tu D等[11]研究表明，M2巨噬细胞孵育的乳腺癌细胞中miR-1587过表达，促进了癌细胞增殖和迁移。宫颈癌中CD163阳性的M2型巨噬细胞浸润与治疗反应和疾病无进展生存期有关[12]。此外，M2型巨噬细胞可促进肿瘤血管的形成，与肿瘤浸润和转移相关。Zhao X等[13]采用Meta分析发现，在4541例乳腺癌患者中，M2型巨噬细胞高密度者浸润性乳腺癌患者生存率较低。本研究中通过分析M2巨噬细胞与临床病理特征的关系，发现CD163阳性数目在乳腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织，其表达与肿瘤直径、WHO分级、TNM分期、PR阴性及淋巴结转移有关，这提示乳腺癌组织中M2巨噬细胞浸润的数量越多，乳腺癌患者肿瘤直径较大、WHO分级较高、TNM分期较晚，肿瘤越容易发生侵袭和转移，免疫组化检测乳腺癌组织中M2巨噬细胞的数量能够反映乳腺癌的发生和发展。

本研究中，Spearman相关性分析结果表明，浸润性乳腺癌组织中EZH2蛋白定量与 CD163阳性巨噬细胞个数呈显著正相关，推测乳腺癌中EZH2表达与肿瘤微环境中CD163阳性的巨噬细胞可能存在协同作用，促进乳腺癌的发生、发展和不良预后。

4 结论

综上所述，EZH2和CD163在乳腺癌中高表达，与乳腺癌的侵袭转移有关，二者表达呈正相关，乳腺癌中EZH2表达与肿瘤微环境中CD163 阳性的巨噬细胞可能存在协同作用促进乳腺癌的发生、发展，对乳腺癌中EZH2和CD163表达规律及相关性研究，能够为乳腺癌靶向治疗提供一定理论依据，其具体机制有待于后续开展更深入的研究。