高效液相色谱法测定椰汁中脱氢乙酸含量的不确定度评定

王攀峰

（山西省检验检测中心（山西省标准计量技术研究院），山西太原 030012）

脱氢乙酸及其钠盐是联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）与世界卫生组织（World Health Organization，WHO）公认的一种低毒、高效、广谱的食品防腐剂，其对霉菌、酵母菌与细菌有着较强的抑制作用，在面包糕点、腌制蔬菜、果汁饮料及熟肉制品等食品加工与贮存过程中广泛使用[1]。然而，部分食品生产企业超限量或超范围使用脱氢乙酸，消费者过量摄入后，会对其肝脏或肾脏造成影响，甚至存在致癌风险[2]。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[3]规定果蔬汁（浆）中脱氢乙酸及其钠盐的最大使用量为0.3 g·kg-1。为加强果汁饮料的日常监管，准确测定其中脱氢乙酸及其钠盐的含量，避免在测定结果接近临界值时出现误判情况，本研究依据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[4]中规定的方法程序，对《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）[5]中高效液相色谱法测定椰汁中脱氢乙酸含量的不确定度进行评定，分析影响测定结果的关键因素，以便提高检测结果的准确性，也为检验检测机构在评估其他检验项目测量不确定方面提供理论基础与科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

椰汁，购自某超市；甲醇中脱氢乙酸标准溶液（浓度为1 000 μg·mL-1），坛墨质检科技股份有限公司；甲醇（色谱纯），德国默克公司；甲酸（分析纯），无锡市亚泰联合化工有限公司；硫酸锌、氢氧化钠（均为分析纯），江苏省亚泰集团化工有限公司。

1.2 仪器与设备

U3000高效液相色谱仪（DAD检测器），美国赛默飞世尔公司；AL104电子天平（精度0.000 1 g），瑞士梅特勒-托利多公司；JL-SPE-12B固相萃取装置，上海靳澜仪器公司；C18固相萃取柱（500 mg/6 mL），常德比克曼生物科技有限公司。

1.3 实验方法

参照《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）中第二法 液相色谱法进行椰汁中脱氢乙酸含量的测定。

1.3.1 标准溶液配制

（1）标准储备液。准确吸取1.0 mL甲醇中脱氢乙酸标准溶液（1 000 μg·mL-1）置于10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，配制成浓度为1 00 μg·mL-1的脱氢乙酸标准储备液。

（2）标准工作液。准确吸取1.0 mL脱氢乙酸标准储备液用超纯水稀释成10 μg·mL-1的标准中间液。分别吸取0.10 mL、0.40 mL脱氢乙酸标准中间液，0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL和1.0 mL脱氢乙酸标准储备液于6个10 mL容量瓶中，用超纯水定容，配制成浓度为0.1 μg·mL-1、0.4 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1的系列标准工作液。

1.3.2 试样制备提取

准确称取2.5 g（精确至0.000 1 g）椰汁试样置于25 mL离心管中，加入10 mL超纯水、5 mL硫酸锌溶液（120 g·L-1），用氢氧化钠溶液（20 g·L-1）调节pH值至7.5，转移至25 mL容量瓶中，用超纯水稀释定容，摇匀，置于离心管中，4 000 r·min-1离心10 min。移取20 mL上清液于25 mL容量瓶中，用10%的甲酸溶液调节pH值至5，用超纯水定容至刻度。将C18固相萃取柱依次用5 mL甲醇、10 mL水活化，取5 mL试液过柱，再用5 mL水淋洗，2 mL 70%的甲醇溶液洗脱，收集2 mL洗脱液，涡旋混匀，过0.45 μm有机滤膜后上机测试。

1.3.3 液相色谱条件

色谱柱：艾杰尔XBP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：10%甲醇+90% 0.02 mol·L-1乙酸铵（体积比）；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；DAD检测器：波长293 nm。

1.4 数学模型建立

建立的数学模型见公式（1）。

式中：X为椰汁试样中脱氢乙酸含量，g·kg-1；m为椰汁试样称取质量，g；V为试液总体积，mL；c1为待测试液中脱氢乙酸的浓度，μg·mL-1；c0为空白试液中脱氢乙酸的浓度，μg·mL-1；f为过固相萃取柱的换算系数，f=0.5。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源

从测定过程与数学模型来看，本试验中测量不确定度主要来源于试样称量、试样制备提取、标准溶液配制、标准曲线拟合及测量重复性等过程。

2.2 测量不确定度分量评定

2.2.1 试样称量过程引入的不确定度分量urel(m)

使用AL104电子天平称取2.500 0 g椰汁试样，由检定证书获得示值误差为±0.000 5 g，偏载误差为±0.000 5 g，重复性误差为±0.001 g，按正态分布考虑，则试样称量过程引入的不确定度为

2.2.2 试样制备提取引入的不确定度分量urel(V)

由数学模型可知，试样制备提取引入的不确定度来自试液定容的总体积，定容过程使用25 mL单标线容量瓶（A级），根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[6]获得容量允差为±0.03 mL，20 ℃时容量校正引入的不确定度按矩形分布，依据公式（2）计算；实验温差为±3 ℃，水膨胀系数为2.10×10-4℃-1，由实验室温差产生的不确定度按矩形分布，依据公式（3）计算。由玻璃量器引入的相对不确定度依据公式（4）计算，求得urel(V)=0.000 78。

式中：ΔS表示玻璃量器的容量允差；V表示玻璃量器移取或定容试液的体积，mL。

2.2.3 标准溶液配制引入的不确定度分量urel(c)

（1）标准溶液赋值。甲醇中脱氢乙酸标准溶液编号为91351A，批号为A22050324，标准溶液证书显示相对扩展不确定度为U=kurel(cb)=2%（k=2），则urel(cb)=2%/2=0.010 0。

（2）标准储备液配制。吸取1.0 mL标准溶液使用的1 mL分度吸量管（A级）的容量允差为±0.008 mL，定容使用的10 mL单标线容量瓶（A级）的容量允差为±0.020 mL，依据公式（2）、（3）、（4）求得urel(V1)=0.004 63，urel(V10)=0.001 21，则该过程引入的相对不确定度为

（3）标准工作液配制。标准中间液配制与储备液配制过程所用玻璃量器相同，引入的相对不确定度urel(c2)=urel(c1)=0.004 79。标准工作液配制时6次使用1 mL分度吸量管（A级），6次使用10 mL单标线容量瓶（A级），该过程引入的相对不确定度为

由此，标准溶液配制引入的相对标准不确定度为

2.2.4 标准曲线拟合引入的不确定度分量urel(q)

将1.3.1中配制的系列标准工作液上机测试，测得峰面积分别为0.025 481、0.131 380、0.334 300、0.818 980、2.294 000和4.674 600。以脱氢乙酸标准系列浓度为横坐标，相应测得峰面积为纵坐标，拟合标准工作曲线，线性方程为Y=0.474 7c-0.084 0，其中b=0.474 7，a=-0.084 0。标准曲线拟合引入的标准不确定度根据以下公式计算。

式中：n为标准工作液测试次数，n=6；p为椰汁试样测试次数，p=6；测得椰汁试样平均值为0.049 4 g·kg-1，代入数学模型中求得c=9.88 μg·mL-1，标准工作液各浓度点的平均值=3.083 3 μg·mL-1。

计算得sR=0.049 96，u(q)=0.103 39 μg·mL-1，则

2.2.5 测量重复性引入的不确定度分量urel(s)

将椰汁试样在期间精密度测量条件下测试6次，结果分别为0.049 5 g·kg-1、0.048 8 g·kg-1、0.049 8 g·kg-1、0.049 1 g·kg-1、0.049 7 g·kg-1和0.049 6 g·kg-1，标准偏差s=0.000 387，则标准不确定度为

相对标准不确定度为

2.3 合成与扩展不确定度

将各个相对不确定度分量进行合成得

则标准合成不确定度为u=0.049 4×0.020 1=0.000 99 g·kg-1。取包含因子k=2，置信概率p=95%，则测量扩展不确定度U=ku=0.002 0 g·kg-1。因此，测量不确定度结果报告为（0.049 4±0.002 0）g·kg-1（k=2，p=95%）。

3 结论

通过分析评定高效液相色谱法测定椰汁中脱氢乙酸含量的测量不确定度，发现标准溶液配制与标准曲线拟合过程对测量结果影响较大，其次为测量重复性、试样制备提取体积及试样称量过程。因此，检验检测机构相关部门要重视玻璃量器与大型仪器的计量检定工作，并督促实验室做好标准溶液与仪器设备的期间核查工作。此外，还应重视实验人员的职业水平培训，提升其实验操作水平技能与对大型仪器设备的维护能力，尽可能地降低测量不确定度，提高检测结果的准确性。