CYP2C19基因多态性对肺部侵袭性真菌感染患儿伏立康唑血药谷浓度的影响及其潜在机制

杨森，吴上志，黄展航，林育能，陈晓雯，谭锦莉，徐清云，卢成瑜，陈德晖*

1广州医科大学附属第一医院儿科，广东广州 510120；2广州医科大学附属第一医院检验科，广东广州 510120

伏立康唑是一种广谱三唑类抗真菌药物，用于治疗侵袭性曲霉病、足放线病菌属、镰刀菌属等所致严重感染及非中性粒细胞减少的念珠菌血症，以及经过其他抗真菌药物治疗后无效或不能耐受的患者[1]，对新型隐球菌、念珠菌、病原性酵母菌等有良好的抗菌活性，亦可用于预防真菌感染[2]。一项纳入9 项研究的Meta 分析显示，伏立康唑治疗和预防儿童深部真菌感染的最佳药谷浓度为1～3 mg/L[3]，低浓度常致临床治疗效果不佳，高浓度则可产生明显的不良反应。伏立康唑主要由细胞色素P450(CYP)酶代谢，尤其是CYP2C19。CYP2C19基因在不同个体中的表型有显著差异，CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*4和CYP2C19*17常发生等位基因缺陷。

CYP2C19基因型对伏立康唑治疗和预防真菌感染效果的影响是目前的研究热点[4-6]，成人此方面的报道较多，但儿童CYP2C19基因型与伏立康唑血药浓度相关性的研究相对较少，伏立康唑药谷浓度在患儿中的差异极大[7]，不仅受CYP2C19基因型和表型的影响，还可能受其他多种因素影响。本研究对使用伏立康唑患儿所携带的CYP2C19基因型、表型和等位基因分布情况进行分析，并探讨其与血清药谷浓度的关系，为临床达到最佳伏立康唑药物浓度提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2013 年9 月－2021 年9 月因肺部侵袭性真菌感染在广州医科大学附属第一医院儿科住院的58例患儿进行回顾性分析。纳入标准：符合英国抗微生物与化疗协会发布的肺部侵袭性真菌感染诊断标准[8]，并同时满足以下条件：(1)病原学检查结果提示应使用伏立康唑或用其他抗真菌药治疗无效，而改用伏立康唑治疗或粒细胞缺乏，无病原学结果而需抢先治疗者；(2)使用伏立康唑疗程需≥5次；(3)伏立康唑起始剂量为6 mg/(kg.d)，1次/12 h。排除标准：(1)年龄>18岁；(2)合并严重的肝肾功能不全需要调整伏立康唑剂量者；(3)拒绝使用伏立康唑或对伏立康唑过敏者。58 例中4 例拒绝行CYP2C19基因检测，最终纳入54 例进行数据分析。本研究获广州医科大学附属第一医院伦理委员会审核批准(C202210040443)。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集及实验室检测 收集患儿年龄、性别、体重、体重指数(body mass index，BMI)等一般临床资料，同时检测血常规、谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷酰转肽酶(gamma-glutamyl transpeptidase，GGT)、血肌酐(creatinine，Cr)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎症指标水平。

1.2.2 伏立康唑血药谷浓度的检测及分组 伏立康唑开始治疗≥5次后进行血药谷浓度检测，即在下一次给药前使用乙二胺四乙酸(EDAT)抗凝管抽取静脉血3 ml，2000 r/min 离心10 min，保留上清液。采用高效液相色谱法-荧光法测定血清伏立康唑浓度。同时记录伏立康唑的起始剂量、给药方式、血药谷浓度等情况。伏立康唑有效的血药谷浓度为0.4～5.0 μg/ml， <0.4 μg/ml 达 不 到 临 床 效 果[9]， 而>5.0 μg/ml则可增加药物的不良反应。由于儿童血清伏立康唑浓度超标的情况较少见，本研究依据血药浓度范围将患儿分为低浓度组(<0.4 μg/ml，n=40)与正常浓度组(0.4～5.0 μg/ml，n=14)。

1.2.3 伏立康唑耐药基因检测 抽取患儿空腹外周静脉血2 ml 于EDTA 抗凝管中，反复颠倒混匀数次，2 h 内送至检验科检测。检测伏立康唑的耐药CYP2C19基因表型，主要有3 种类型：快代谢型(extensive metabolizer，EM，CYP2C19*1/*1)、中代谢型(intermediate metabolizer， IM，CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3)、慢代谢 型(poor metabolizer，PM，CYP2C19*2/*2、CYP2C19*3/*3、CYP2C19 *2/*3)。检测过程：(1)全血伏立康唑耐药基因组DNA 的提取。采用上海百傲科技有限公司生产的血液基因组DNA 提取试剂盒进行提取，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。随后检测DNA的浓度和纯度，DNA的浓度须达到10～60 ng/μl，A260/A280比值为1.7～2.0，然后进行下一步实验。如不能立即检测，DNA产物应保存在-20 ℃冰箱，以防DNA 降解。(2)PCR 扩增。按照CYP2C19基因检测试剂盒准备好扩增液，在各扩增管中加入1 μl PCR 扩增酶液和5 μl 提取的样品DNA溶液，振荡混匀，12 000 r/min离心15 min。将各管放入PCR 仪中，扩增条件如下：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s、48 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 5 min。取出扩增产物，2～8 ℃保存。

1.2.4 杂交显色和结果判读 取出显色杂交试剂盒，按照使用说明书将完成杂交的芯片置入BE-2.0 生物芯片识读仪的扫描窗口，启动配套的芯片分析系统，扫描芯片并对结果进行分析。不同基因型对应不同的显色模式，根据软件读取的显色模式，判断各个患儿的基因型。基因型和表型对应的基因模式图见图1。

图1 不同基因型及表型的芯片显色模式Fig.1 Chip color rendering mode of different genotypes and phenotypes

1.2.5 指标分析 分析CYP2C19基因型及等位基因在肺部侵袭性真菌感染患儿中的分布情况，比较不同基因型及等位基因对伏立康唑血药浓度的影响；比较低浓度组与正常浓度组患儿年龄、肝肾功能(GGT、ALT、Cr)、炎症指标(CRP、IL-6)的差异，并进一步分析伏立康唑血药浓度的影响因素。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。计量资料采用Shapiro-Wilktest法检验数据是否符合正态分布，符合正态分布者以x±s表示，两组间比较采用t检验，偏态分布者以M(Q1，Q3)表示，两组间比较采用秩和检验；计数资料以例或%表示，两组间比较采用χ2检验，不同药谷浓度下基因型和等位基因的差异采用Bonferroni 校正分析；采用二元logistics 回归分析年龄、BMI、CRP、IL-6、ALT、Cr对患儿伏立康唑血药谷浓度的影响。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 患儿的基本特征 58例患儿病因包括社区获得性肺炎并急性肺部真菌感染42例(有肺部基础疾病26例)，原发免疫缺陷病6例，化疗相关粒细胞缺乏所致感染10 例。4 例存在肺部基础疾病患儿拒绝行CYP2C19基因检测，其余54 例纳入本研究。其中，男35 例(64.8%)，女19 例(35.2%)，年 龄2.7(1.2，6.5)岁，BMI 15.3(13.5，16.5) kg/m2；其中伏立康唑口服10例(18.5%)，静脉输注44 例(81.5%)。两组患儿的肝肾功能基线特征无统计学差异(P>0.05)；炎症指标和伏立康唑血药谷浓度差异有统计学差异(P<0.05)(表1)。

表1 两组患儿炎症指标及药谷浓度比较[M(Q1, Q3)]Tab.1 Inflammatory indicators and drug minimum concentration of included children with invasive fungal infections in lungs[M(Q1, Q3)]

2.2CYP2C19基因型、表型分布及在不同血清药谷浓度患儿中的分布 完成检测的54例样本中共检出4种CYP2C19基因型，其中*1/*1(636 GG，681 GG)基因型患儿最多(30 例)；其余患儿基因型依次为*1/*2(636 GG，681 GA，20 例)、*1/*3(636 GA，681 GG，2 例)和*2/*3(636 GA，681 GA，2 例)，未检出*2/*2(636 GG，681 AA)基因型和*3/*3(636 AA，681 GG)基因型患儿。54例中，30例CYP2C19*1/*1型为快代谢型，22 例CYP2C19*1/*2 和CYP2C19*1/*3 型为中代谢型，2 例CYP2C19*2/*3 为慢代谢型。CYP2C19*1/*1、CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*3 基 因型对患儿伏立康唑血药浓度的影响差异有统计学意义(趋势χ2=7.008，P=0.045)；以CYP2C19*1/*1为参考值，采用Bonferroni 校正法进一步行两两比较显示，与CYP2C19*1/*1 比较，CYP2C19*2/*3 对血药浓度的影响差异有统计学意义(P=0.006)。正常浓度组与低浓度组在快代谢和慢代谢基因型间差异均有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 CYP2C19基因多态性在不同药物浓度患儿中的分布Tab.2 Distribution of CYP2C19 gene polymorphism in different drug concentrations

2.3CYP2C19等位基因频率及等位基因在不同药物浓度患儿中的分布 54 例患儿中，等位基因CYP2C19*1 出现的频数为82，频率最高，为75.9%；等位基因CYP2C19*2 出现的频数为22，频率为20.4%；等位基因CYP2C19*3 出现的频数为4，频率为3.7%。CYP2C19*1、CYP2C19*2、CYP2C19*3 等位基因型对患儿伏立康唑血药浓度的影响差异有统计学意义(趋势χ2=6.782，P=0.026)；以CYP2C19*1 为参考值，采用Bonferroni 校正法进一步行两两比较显示，与CYP2C19*1比较，CYP2C19*2对血药浓度的影响差异有统计学意义(P=0.026)。CYP2C19*1、CYP2C19*2 等位基因在正常浓度组与低浓度组差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3 CYP2C19等位基因在不同药物浓度患儿中的分布Tab.3 Distribution of CYP2C19 allele in different drug concentrations

2.4 影响伏立康唑药谷浓度的相关因素分析 二元logistics回归分析结果显示，BMI、CRP、IL-6和基因型对伏立康唑药谷浓度有明显影响(P<0.05)，其中BMI、CRP可升高伏立康唑血药浓度，而IL-6和基因型可降低伏立康唑血药浓度。患儿年龄、ALT 及Cr对伏立康唑血药谷浓度无明显影响(P>0.05)(表4)。

表4 影响伏立康唑血药谷浓度的相关因素分析Tab.4 Analysis of the related factors affecting the blood minimum concentration of voriconazole

3 讨 论

伏立康唑主要通过肝脏细胞色素P450 酶CYP2C19 代谢[10]，也可经CYP3A代谢[11]，还有少部分经CYP2C9 代谢[12]。不同基因型对伏立康唑药代动力学的影响十分明显。CYP2C19基因型及表型常见的有以下几种：CYP2C19*1/*17 为超快代谢型(UM)，CYP2C19*1/*1为快代谢型(EM)，CYP2C19*1/*2和CYP2C19*1/*3 为 中 代 谢 型(IM)，CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*3/*3 为 慢 代 谢 型(PM)[13]。然而根据CYP2C19基因型和催化能力可分为UM、EM、IM和PM四种代谢型，其中EM为CYP2C19*1/*1野生纯合子，UM为CYP2C19*17基因突变，IM包括CYP2C19*1/*2 和CYP2C19*1/*3 杂合子两种基因型，PM 基 因 型 则 包 括CYP2C19*2/*3、CYP2C19*2/*2 和CYP2C19*3/*3。当CYP2C19为PM[10](即纯合突变，*2/*2、*2/*3、*3/*3)时，伏立康唑代谢极慢[5]，其暴露浓度为EM(即野生型，*1/*1)的3～4 倍[14]；当CYP2C19为IM(即杂合突变，*1/*2、*1/*3)时，伏立康唑代谢减慢，其暴露浓度为EM 的1.5～2 倍[15]，可能导致药物不良反应的发生风险明显增高[14]。相反，当CYP2C19为UM时(*1/*17或*17/*17)，伏立康唑的暴露浓度相比正常代谢降低约50%[16]，因此，使用标准剂量治疗时，暴露浓度低是治疗失败的一个重要原因。本研究发现，患儿中以EM 和IM 居多，共占96.3%，与亚洲地区成年人CYP2C19弱代谢者发生率不一致[17]，可能与本研究所纳入病例种类不同或样本量较小有关。

CYP2C19具有遗传多态性，是引起个体和种族间对同一药物表现出不同代谢能力的原因之一[18]。CYP2C19基因突变导致编码的酶活性改变，产生不同的表型。CYP2C19*1/*1 型无突变位点，酶活性正常，表型为EM；CYP2C19*1/*2和CYP2C19*1/*3型为杂合突变，突变位点分别为681G>A 和636G>A，酶活性为中间型， 表型为IM；CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*3/*3型为纯合突变，突变位点为681G>A和636G>A，酶活性弱，表型为PM。白种人和黑种人中CYP2C19弱代谢者发生率为3%～5%，而亚洲人中弱代谢者发生率则高达15%～20%[19]。对健康白种人和健康日本人的研究结果显示，同一种族中弱代谢者伏立康唑的血药浓度较强代谢者高4 倍以上[19-20]。一项来自加沙地带健康儿童的CYP2C19基因型流行病学调查表明，CYP2C19的*1/*1、*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3、*3/*3 基因型占比分别为86.5%、6.5%、3.0%、1.5%、2.0%、0.5%[21]。本研究中CYP2C19*1/*1、*1/*2 基因型是常见的类型，以快代谢和中代谢表型居多，与文献报道一致。既往研究发现，亚洲人群中UM 代谢类型占比仅约4%[16,22]，而PM 占比为12%～23%，检测CYP2C19*2和CYP2C19*3两个位点即可覆盖99%以上的突变类型[20]。 本 研 究 发 现， 等 位 基 因CYP2C19*1和CYP2C19*2占比为97%，与文献报道不一致，可能存在地域或人种的差异。

本研究对影响伏立康唑血药谷浓度的相关因素(年龄、BMI、CRP、基因型、肝肾功能)进行分析，结果显示，CRP 和基因型对药谷浓度有明显影响(P<0.05)。CRP较高时，药谷浓度也较高，考虑可能的原因为：CRP 是反映炎性严重程度、炎症急性时相的非特异性指标，主要受IL-6 的调控，而IL-6 和一些上游促炎因子均可下调CYP2C19和CYP3A4基因的表达，最终导致药谷浓度升高[23]；CRP 和IL-6 同为炎性因子，CRP 主要在肝脏产生，而IL-6 主要由粒细胞和淋巴细胞产生且为CRP 的上游促炎因子，这可能是IL-6 和CRP 对血药浓度的影响不一致的原因，与文献研究结果相似[24]。本研究还发现，PM的药谷浓度明显高于EM(P<0.05)，且PM 患儿的CRP较高时具有更高的药谷浓度，提示PM与EM患儿使用相同剂量药物时可导致药谷浓度上升，因此，应降低患儿的起始用药剂量，密切关注不良反应的发生[6,25-26]。此外，建议所有使用伏立康唑治疗的患儿应尽早进行耐药基因检测，以便更早地达到有效的药谷浓度，及时调整药物剂量，减少药物不良反应，并提高治疗效果。

综上所述，本研究发现，伏立康唑用于儿童肺部侵袭性真菌感染的治疗效果与CYP2C19基因多态性密切相关，CYP2C19基因型决定了代谢表型，影响了伏立康唑的血药谷浓度，进而影响了临床效果，与文献报道的结果一致[4,27-28]。进一步分析发现，BMI、CRP、IL-6也同样可影响药谷浓度，提示在使用伏立康唑治疗侵袭性真菌感染患儿时，除基因外还应关注其他指标，以提高用药安全性。本研究仍存在一些不足之处：(1)研究对象仅限于侵袭性真菌感染的儿童患者，未纳入成人进行对比分析；(2)为只针对中国人种的小部分研究；(3)是一项回顾性研究，不能证明因果关系，只能说明相关性和影响因素。未来有待设计高质量的随机对照临床试验来验证本研究结果的可靠性。总之，尽早完成侵袭性真菌感染患儿的CYP2C19基因型检测并关注炎性因子的变化，可合理指导患儿首次给药的剂量，尽快达到有效的药谷浓度，为伏立康唑合理、安全、有效地运用于此类患儿的治疗提供临床依据。