酸敏感离子通道3对肠易激综合征大鼠内脏高敏感性的影响及其机制

张立霞，闫波，潘颖，田平平，张卫洁，李欢，袁丽萍*

1安徽医科大学第一附属医院儿科，安徽合肥 230022；2安徽医科大学附属宿州医院儿科，安徽宿州 234000；3安徽医学高等专科学校医学技术系，安徽合肥 230026

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是儿童常见的一种慢性反复发作的功能性胃肠病，主要特征为腹痛、腹胀、排便习惯改变及大便性状异常(腹泻、便秘、黏液便等)。IBS在儿童时期发病率很高，全球约20%的学龄儿童生活和学习情况受到其影响[1]。IBS的具体发病机制尚未完全明确，目前认为与饮食、环境、炎症、感染、精神等因素导致的“脑-肠轴”互动异常以及肠道动力、内脏敏感性改变有关[2]。酸敏感离子通道(acid-sensing ion channel，ASIC)是可被酸激活的通道蛋白，能够对炎症、疼痛、癫痫等病理反应产生响应，这些病理反应的共同特点是组织酸化，而肠道在多种异常代谢产物的影响下亦可出现肠组织酸化，产生相似的病理反应。ASIC被证实在胃肠道内广泛分布，并可对胃肠道酸环境的改变做出反应，从而维持胃肠道功能的稳定。既往研究发现，大鼠接受便秘患儿粪菌移植后其结肠组织中ASIC3表达水平明显升高[3]，但ASIC3在母婴分离(neonatal maternal separation，NMS)大鼠IBS 内脏高敏感性形成中的作用及机制尚未完全明确。目前的研究显示，5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)通路与肠道动力、内脏敏感性密切相关[4-5]。本研究采用NMS法建立IBS大鼠模型，肠道动力及5-HT通路的影响，探讨ASIC3对IBS大鼠内脏敏感性的影响及5-HT 信号通路在其中的作用，以期找到IBS 新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 SPF 级健康SD 孕鼠3 只，孕龄16～20 d，体重260～280 g，购自安徽医科大学实验动物中心。大鼠饲养条件符合SPF级动物饲养环境，温度设置为(22±2) ℃，相对湿度控制在45%～60%，光照/黑暗时间为12 h/12 h，自由饮水、进食；待孕鼠分娩幼鼠，每只孕鼠分娩约10 只幼鼠。ASIC3 抑制剂APETx2购自上海信裕生物科技有限公司，外径4 mm硅胶导管、4～6 cm的柔软乳胶指套购自北京泽平科技公司，异氟醚、石蜡、印度墨汁、2%戊巴比妥钠购自福州迈新公司，4%多聚甲醛溶液购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 IBS模型的建立及分组 产后第2天开始，将分娩的6 只幼鼠与母鼠继续在原笼中饲养，作为对照组；其余幼鼠取出分别放入另一笼中饲养，每天将母鼠与幼鼠分离3 h，3 h后将两组幼鼠分别放回原笼中，直到第21天结束。第22天所有幼鼠断奶后单独饲养，于自然环境下饲养至第8 周(即大鼠成年)，体重220～240 g。对NMS 大鼠采用腹部回撤反射(abdominal withdraw reflex，AWR)评分来检测内脏痛反应，AWR评分明显升高即为造模成功。选取造模成功的16 只大鼠随机分为NMS 组(n=8)与NMS+APETx2 组(n=8)。NMS+APETx2 组 每 日 腹 腔 注 射100 μg/kg APETx2，而NMS 组及对照组腹腔注射等量生理盐水，持续1 周。本实验过程符合国家及单位有关实验动物的管理及使用规定。

1.2.2 内脏敏感性评估 实验前3 d 将大鼠放入20 cm×8 cm×8 cm的有机玻璃观察箱内，每天30 min，使大鼠适应该密闭环境，以减少实验环境造成的误差。在外径4 mm 硅胶导管的一侧末端，系一长4～6 cm 的柔软乳胶指套制成气囊，导管另一末端与内脏扩张器连接，实验前预扩张充气24 h 检查气囊的密闭性。AWR评分实验：大鼠给予异氟醚轻微吸入麻醉，然后放入观察箱，将涂石蜡油的气囊轻柔地经肛门插入大鼠直肠内，气囊末端需深入肛门内1～2 cm，在肛门外1 cm 处用胶布将导管紧紧固定在大鼠尾根部，以防止导管移位。气囊给予不同压力(20、40、60、80 mmHg)刺激，引起大鼠疼痛，表现为不同程度内脏痛引起的行为学反应。大鼠AWR评分标准：0 分，对结直肠扩张实验无反应性；1 分，大鼠表现为活动停顿后短暂头部运动行为；2分，大鼠存在腹部肌肉收缩；3分，大鼠有腹部抬起行为；4分，大鼠身体拱起，并抬起盆腔和阴部。

1.2.3 肠道动力测定 大鼠禁食24 h，经口灌入印度墨汁0.5 ml，30 min后腹腔注入50 mg/kg 2%戊巴比妥钠，麻醉起效后处死大鼠并剖腹，取出从贲门至直肠末段的肠段，测量小肠全长及墨汁在小肠推进的距离，计算墨汁推进距离占小肠全长的百分比，即为肠道传输速率。公式如下：墨汁推进率(%)=墨汁在小肠内推进的距离(cm)/小肠全长(cm)×100%。

1.2.4 结肠组织5-HT水平检测 将处死后的小鼠结肠取出，保存于-80℃冰箱。采用ELISA方法检测结肠组织中5-HT的水平。

1.2.5 免疫组化检测结肠组织5-HT4 受体及ASIC3的表达水平 将结肠组织固定于4%多聚甲醛溶液中，经包埋、切片、脱蜡、水化、DAB 显色、封片等处理，显微镜下观察切片，随机选取视野拍照，以5-HT4 受体及ASIC3 表达阳性作为标准，应用Image Pro Plus 软件计算每张照片的累积光密度值(integrated optical density，IOD)。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0 软件进行统计分析。所有数据均以x±s表示，大鼠在不同压力下的AWR评分比较采用两因素方差分析，其余指标比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠肠道敏感性比较 随着气囊压力增大，各组间AWR 评分出现变化：与对照组比较，NMS 组大鼠腹部疼痛反应较重，压力为40、60、80 mmHg 时，AWR 评分明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)，而NMS+APETx2 组AWR 评分与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与NMS 组比较，压力为40 mmHg 和80 mmHg 时，NMS+APETx2 组大鼠AWR评分明显降低，腹部疼痛反应减轻，差异有统计学意义(P<0.05)。与压力为20 mmHg时比较，压力为40 mmHg 时的NMS 组，60 mmHg 时的NMS 组、NMS+APETx2 组，以及80 mmHg 时的对照组、NMS组、NMS+APETx2组AWR评分明显升高，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；与压力为40 mmHg时比较，压力为60 mmHg时的NMS组、NMS+APETx2组及80 mmHg 时的对照组、NMS 组、NMS+APETx2 组AWR 评分明显升高，差异有统计学意义(P<0.01 或P<0.05)；与压力为60 mmHg 时比较，压力为80 mmHg 时的对照组、NMS 组AWR 评分明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)(表1)。

表1 各组大鼠在不同压力下的AWR评分比较(x±s)Tab.1 Comparison of AWR scores of rats in each group under different pressures (x±s)

2.2 各组大鼠肠道动力比较 与对照组(64.55%±3.76%)比较，NMS 组大鼠小肠墨汁推进率(46.38%±4.32%)降低，差异有统计学意义(P<0.01)，而NMS+APETx2 组小肠墨汁推进率(59.79%±5.26%)与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与NMS 组比较，APETx2 阻断ASIC3 后，NMS+APETx2 组大鼠小肠墨汁推进率明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 各组大鼠结肠组织5-HT 水平变化 与对照组[(3.71±0.32) mg/ml]比较，NMS 组、MS+APETx2组大鼠结肠组织5-HT 水平[分别为(66.78±29.69) mg/ml、(26.56±6.38) mg/ml]明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；而与NMS组比较，APETx2阻断ASIC3后，NMS+APETx2 组大鼠结肠组织5-HT 水平[(26.56±6.38) mg/ml]明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4 各组大鼠结肠组织5-HT4 受体及ASIC3 表达变化 与对照组比较，NMS组、MS+APETx2组大鼠结肠组织5-HT4 受体及ASIC3 表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与NMS 组比较，APETx2阻断ASIC3后，NMS+APETx2组大鼠结肠组织5-HT4受体及ASIC3 表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)(图1)。

图1 免疫组化测定大鼠结肠组织中5-HT4受体(A)及ASIC3(B)表达水平(DAB)Fig.1 Expressions of 5-HT4 receptor (A) and ASIC3 (B) of rat colon tissue by immunohistochemical analysis (DAB)

3 讨 论

IBS是儿童时期最常见的一种功能性胃肠病，其症状的产生与动力紊乱、内脏高敏感性、黏膜和免疫功能改变、肠道菌群变化及中枢神经系统调节功能异常有关。其中，内脏高敏感性是IBS 主要的病理生理机制之一，是胃肠功能紊乱、腹痛及症状多样化的原因，也是IBS 的生物学标志[6-7]。本研究发现，NMS后大鼠肠道敏感性增高，提示NMS可导致IBS 的产生，与国内外文献报道一致[8-9]。此外，NMS 后结肠组织中ASIC3 表达水平明显升高，而APETx2 阻断后其结肠组织中ASIC3 表达水平则明显降低，内脏敏感性降低，肠道动力也明显好转，提示ASIC3 参与了IBS 内脏敏感性的产生，可能与IBS的发生有关。

ASICs 是NAC/DEG 钠通道家族成员，有7 个不同亚基，广泛存在于人体内；目前在胃肠道炎性疾病如幽门螺杆菌感染所致胃炎、粪菌移植导致的IBS中，与痛觉过敏关系密切的是ASIC3亚型[3，10]，其激活与细胞外H+的变化密切相关。Gregory 等[11]发现，在运动应激、缺血缺氧、感染等条件下，肌肉组织出现酸中毒、pH 值下降等改变，ASIC3 表达明显增高，疼痛敏感性增高，且ASIC3 表达水平升高与局部组织的pH值下降呈正相关。在大量肠道微生物代谢产物(如短链脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸等)、胆汁酸的作用下，IBS 患儿肠道pH 值明显降低[12]。同时有研究发现，IBS患儿肠黏膜屏障损伤、肠道通透性改变可使肠道内毒素水平升高并产生促炎因子，从而引起慢性低度炎症[13]，也可导致肠道pH 值降低。因此，笔者推测NMS 法建立的IBS 模型大鼠肠道组织中ASIC3 表达水平升高与肠道局部pH 值降低有关。有研究证实，ASICs在胃肠道信息处理过程中发挥重要作用，其中ASIC3 主要参与胃肠道机械敏感性的调节，敲除ASIC3可降低胃肠道内脏敏感性[14]。本研究也发现，阻断ASIC3可降低IBS大鼠的内脏敏感性，但ASIC3参与内脏敏感性的机制尚不明确。

5-HT是人体的一种重要神经递质，广泛存在于外周及中枢神经系统。外周神经系统中95%的5-HT来源于胃肠道，发挥调控胃肠道感觉、运动及内分泌等作用[15]。Qin 等[16]发现，IBS 患者的肠道在受到炎症或化学等刺激时，嗜铬细胞或肥大细胞可脱颗粒分泌5-HT，使5-HT 水平明显升高，而5-HT 信号系统可介导肠道感觉、运动功能的改变，进而出现IBS的临床表现。Zhu等[17]发现，采用电针治疗炎症后的IBS，可使结肠内嗜铬细胞数量减少，5-HT 水平降低，腹部AWR评分下降，内脏痛觉减弱，提示其镇痛作用可能是通过5-HT 介导的。5-HT 可通过与胃肠道不同效应器细胞上的不同5-HT 受体结合，调节胃肠感觉、运动及内分泌功能，其中5-HT3 受体、5-HT4 受体与肠道动力及敏感性关系尤为密切[18-19]。Fu 等[20]发现，5-HT3 受体激活后，可刺激神经末梢释放乙酰胆碱，从而促进平滑肌收缩及腺体分泌，而5-HT4 受体可表达于肠道神经元、平滑肌细胞及上皮细胞，其中位于肠道神经元的5-HT4受体兴奋可增强胃肠道动力。人类平滑肌上的5-HT4 受体则可介导平滑肌的舒张，其分布不同，功能有所差异，在肠道内主要调控胃肠道的运动[21]。本研究发现，与对照组比较，IBS大鼠存在内脏高敏感性，结肠组织中的5-HT 分泌明显增多，且5-HT4受体、ASIC3表达水平明显升高；应用ASIC3阻断剂APETx2 后，IBS 大鼠结肠组织ASIC3 表达水平明显降低，内脏高敏感性下降、肠道运动恢复，同时结肠组织中5-HT 分泌减少、5-HT4 受体表达水平降低，提示阻断ASIC3 可改变内脏高敏感性，其机制可能与5-HT、5-HT4受体信号通路调控有关。

综上所述，NMS 后IBS 大鼠肠道组织中ASIC3表达增加，ASIC3 阻断剂APETx2 可抑制IBS 大鼠肠道组织ASIC3的表达，改善IBS大鼠内脏敏感性，可能与APETx2 阻断ASIC3 进而抑制5-HT 分泌、下调5-HT4 受体表达有关。因此，ASIC3 可能成为未来IBS内脏高敏感性的治疗新靶点。但本研究仍存在不足之处，实验仅设计了单一IBS模型探讨ASIC3致内脏高敏感性及其中5-HT信号通路的调节机制，后续可设计多种IBS 模型来进一步验证ASIC3 致IBS 内脏高敏感性的发生机制。