直接蛋白沉淀-超高效液相色谱法测定氟尿嘧啶血药浓度

纪梅芳,卢桂清

(厦门大学附属第一医院,福建 厦门 361000)

氟尿嘧啶在临床上得到广泛应用,属于抗代谢类化疗药物。氟尿嘧啶治疗能够对患者体内DNA、蛋白质、RNA合成起到抑制作用,因此被广泛应用于消化道肿瘤等疾病的治疗中,除此之外,还具有价格低等优势。因此在临床上被广泛应用[1]。不同患者代谢酶的活性有所不同,从代谢速率方面分析,不同患者的代谢速率不同[2-3]。血药浓度偏高会导致患者不耐受。因此,需要对患者合理调节氟尿嘧啶用药剂量,提升化疗疗效。在临床上,检测血药浓度意义显著。氟尿嘧啶血药浓度检测,主要包含液相色谱法、气相色谱法等[4-5]。上述方法适用范围有所差异,存在不同的优点和缺点。本研究分析直接沉淀蛋白与超高效相色谱法联合使用的技术,旨在提升检测效率,降低检测成本。通过在临床患者血药浓度检测中应用上述检测方法,观察临床应用效果。

1 材料与方法

1.1 资料

选择氟尿嘧啶化学标准品,由中国食品药品检定研究院提供,批号为100187201203。氯尿嘧啶化学标准品,是由化学技术有限公司提供,标准品批号设置为LG90J03。选择高氯酸,此样品是由国药集团化学试剂有限公司生产。选择乙酸,由南京化学试验有限公司生产。选择甲醇,色谱纯,由江苏汉邦科技有限公司生产。乙腈(色谱纯,美国Merck公司)。水为蒸馏水。采仪器包含高速离心机,由德国艾本德公司生产。超高效业相色谱仪由美国公司生产,配备PDA检测器。

1.2 研究方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱:quity HSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm):流动相:水-乙腈(95:5),使用微孔滤膜过滤,流速为每分钟0.2mL,将波长设置为265纳米,柱温设置为20℃。5℃作为进样室温度,5μL为进样量。

1.2.2 内标溶液和标准储备液的制备

工作人员不仅制备内标溶液,同时需要制备标准储备液,称取5-氟尿嘧啶5g,将上述物品放置在100mL量瓶中,应用甲醇进行定容,浓度为1.92μg。将甲醇稀释到10倍之后,最后得到质量浓度为0.192μg/mL的溶液,作为内标溶液。内标溶液放置在8℃的冰箱里,保存时间为60天。

标准储备液,称取5-氟尿嘧啶标准品0.1g,将其放置在100mL量瓶中,使用水稀释,稀释至刻度,作为标准储备液,在温度低于8℃,能够保存60日,在使用时,逐级稀释为100μg/mL、50μg/mL、10μg/mL、1μg/mL的工作液。

1.2.3 预处理样品

对样品进行处理:300μL血清样品,将其放置在10mL尖底离心管中,使用100μL平底进样针,将其放置在50μL内标溶液中,将离心管中液体混匀。准确加入到浓度为6%高氯酸溶液,为200μL为高氯酸溶液,将上述溶液作为蛋白沉淀剂,进行混匀处理,处理时间为5分钟。在样品充分混匀之后,将样品实施低速离心,离心速度为每分钟4000转,有利于沉淀相与上清液分离。进样时,通过每分钟1000转,实施离心后,供试剂为100μL。

1.2.4 色谱分离情况

色谱分离情况,空白血清色谱图,观察5-氟尿嘧啶出峰时间、5-氯尿嘧啶的出峰时间,未观察到显著杂质干扰,峰形分离良好,氟尿嘧啶保留时间为1.8分钟,设置氯尿嘧啶保留时间2.85分钟。见图1。

1.2.5 血清处理

选择6份建卡空体检者的血清,在处理后,6份血清样本氟尿嘧啶与氯尿嘧啶的保留时间均处于无干扰状态,说明本法具有良好专属性。

1.2.6 氟尿嘧啶的检测

配制0.5、10、30μg/mL,质量浓度的氟尿嘧啶血清样本为5份,合理处理,计算出血药浓度,回收率需要合理计算。精密度在考察阶段,将配置好的相同浓度样品,24小时,5次连续进样,内精密度合理计算。每日计算一次,连续计算5天。结果发现测定精准度与精密度符合要求。

1.2.7 检测限

检测限是指检测信号为噪声信号的3倍时,对应的血样浓度,此种方式检测限为0.1μg/mL。

1.2.8 血药浓度检测

本次研究所用方法,检测静脉滴注氟尿嘧啶的血药浓度。临床研究显示,胃癌患者血药浓度需要控制在25.6～37.4μg/mL时,不良反应发生概率较小,同时具有良好效果,但是氟尿嘧啶的血药浓度大于3μg/mL时,患者出现不良反应发生率较大。

2 结果

在本次研究中,有1例患者的血药峰浓度较低,1例患者血药谷浓度大于常规标准,患者出现严重黏膜损害,发生骨髓抑制反应。通过与医护人员进行沟通,调整治疗方案,患者化疗后产生的不良反应降低。

3 讨论

高效液相色谱法,可以称为高分离度液相色谱、高压液相色谱法等。高效液相色谱方法较为重要,流动相为液体形式。通过应用高压输液系统,将级性不同的单一溶剂、混合溶剂不同,缓冲液等流动相泵入装有固定项的色谱柱。采用分离方式,需要进行处理,使用检测器处理,能够实现分析试样[6-7]。此种方式可以应用在法学、分离化学、工业、商检以及医学等重要领域中。

高效液相色谱,能够反复使用色谱柱,不容易将样品破坏,具有回收等优势。但同时也存在一定缺点,和气相色谱比较,能够取长补短。高效液相色谱具有缺点,包含外效应。从进样开始直到检测器结束,除了柱子以外的任何死空间,包含进样器以及检测池、联合连接管等,一旦流动相的流型出现改变。有分离物质被滞留或者出现扩散现象,都会造成色谱峰加宽,减弱柱效率[8-9]。

血液样本成分较为复杂,采用复杂预处理方式,通过浓缩和富集等方式,将干扰物质除去,才能够实施UPLC分析。直接蛋白沉淀法有效,检测速度快。常用的蛋白质沉淀剂有硫酸铵溶液、乙酸乙酯等。通过采用预实验方式,最后选择浓度为6%的高氯酸溶液,可以将内源干扰物去除,同时不会影响氟尿嘧啶和内标的稳定性。T3柱属于一种耐受100%水相,长时间冲刷的特殊性色谱柱,水溶性药物分离效果良好。本次研究采用T3柱,柱效与分离度符合测定要求。

液相色谱方式在初期阶段,只用大直径的玻璃管做柱,在常压下或者在室温下,使用液位差,输送流动性,将其称之为经典液相色谱法。此种方式具有较低柱效,同时时间较长,在几个小时。高效液相色谱法在60年代后期被引入,逐渐被发展起来。此种方式与经典的液相色谱法相比较,主要区别为填料颗粒小,同时具有均匀特点,小颗粒具有高速效特点,具有高阻力特点,应用高压输送流动相,因此将其称为高压液相色谱法。由于分析速度快,因此将其称为高速液相色谱法,也可以称之为现代液相色谱。

在制定色谱柱的填料和流动相的组分过程中,需要根据各品种相进行设定。常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。比较常见为十八烷基硅烷键合硅胶,其次为辛基键合硅胶,氨基键和氰基逐渐在临床被应用;离子交换色谱期间,通常使用离子交换填料等,注样量为微升。还有其他规定,室温为柱温,紫外吸收检测器可以作为检测器。对于规定的条件,除固定相种类之外,不能改变检测器类型,载体粒度、色谱柱内径、固定相牌号、混合流动相各组分比例、检测器灵敏度等均可以进行改变,需要适当符合系统的要求。一般色谱图大约在20分钟,能够完成记录。

在对仪器进行适应性实验过程中,需要根据系统适应性实验,按照各品种项下要求作为标准。通过不断实验和调整仪器,让所用样品达到规定要求。或者规定分析状态下,制定最小的色谱柱理论板数。如果在样品中,包含可离子化的化合物,或者包含离子型化合物,则可以采用离子交换色谱方式,但是由于液液分配色谱,或者空间排阻,也能够顺利的应用离子化合物。在实施分离异构体期间,可以采用液固色谱法;官能团的化合物存在差异,也可以采用液液分配色谱法;对于高分子聚合物,实施空间排阻色谱方法。HPLC出现时间较短,但是发展速度较快,目前应用也十分广泛,流程与仪器机构具有多样性特点[10-11]。通过用厚壁玻璃管进行制作,样品出现腐蚀,要求耐高压,可以采用铜管等[12]。

为患者实施血样定量检测期间,需要与样本一起做标准曲线,能够减少定量误差。随行标准曲线获得方法良好,采用超高效液相色谱技术,是新的技术之一,通过对小颗粒固定相进行应用,降低系统体积。本次研究采用直接蛋白沉淀-超高效液相色谱连用技术,用于测定氟尿嘧啶,在5分钟之内,能够分析整个进样,临床检测需求得以满足。临床血样检测,以及后期干预实践,此种方法临床应用前景更好。部分学者分析,氟尿嘧啶长时间输注期间,可以将血药浓度稳定,代替血药浓度曲线下面积。氟尿嘧啶静脉滴注给药期间,2小时左右,血药浓度得以稳定,在22小时之后,血药浓度具有较小差异。因此选择氟尿嘧啶持续静脉滴注22小时差异性较小。结果显示,患者间氟尿嘧啶血药浓度具有较大差异性,主要与以下因素相关,包含药物代谢酶的基因存在差异,食物与药物之间发生作用,与身体状况有一定关联。部分研究分析,直接检测细胞DPD的活性,结果发现氟尿嘧啶的血浆水平相关性较弱,但是会浪费更多时间,因此在为患者化疗之前,需要测定药物浓度,可以作为间接指标,帮助患者判断活性缺陷,预测毒性。在本次研究中,其中1例患者血药峰浓度低于20μg/mL,另外1例患者血药浓度>3μg,患者出现严重黏膜损害,甚至发生骨髓抑制反应。通过与医护人员进行沟通,调整治疗方案,患者化疗后产生的不良反应降低。