豌豆不同器官浸提液中化感物质鉴定及差异性分析

摘要：豌豆生產中面临连作障碍，严重影响其产量和品质，但其发生机理未被完全揭示。化感物质引发的自毒效应是连作障碍发生的重要原因之一，为了给进一步研究豌豆化感物质在豌豆连作障碍的作用提供参考。以不同基因型豌豆定豌10号、云豌8号为指示品种，对其苗期的根茎叶浸提液进行了气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析，以明确豌豆不同器官中化感物质的差异。结果表明，云豌8号不同器官中化合物种类均高于定豌10号。2种豌豆的地上部器官中化合物种类多于根系。不同器官中相对含量较高的化感物质种类存在差异。其中，抗氧化剂2246除定豌10号的叶片浸提液外，在2种豌豆的不同器官浸提液中均存在。此外，棕榈酸和芥酸酰胺在云豌8号的不同器官浸提液中均存在，肉桂酸仅在定豌10号茎浸提液中存在。综上，豌豆不同器官浸提液中均存在化感物质，但其种类因器官类型和豌豆基因型而异。

关键词：豌豆；不同器官浸提液；化感物质；GC-MS

中图分类号：S643.3               文献标志码：A              文章编号：2097-2172（2023）11-1056-07

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.11.015

Identification and Differential Analysis of Allelopathic Substances in

Different Organ Extracts of Peas

ZHENG Lilong

（Institute of Agricultural Economics and Information，Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： Pea production is confronted with continuous cropping obstacle that seriously affects pea yield and quality， while the mechanism of  its occurrence is not fully understood. The autotoxic effect induced by chemosensory substances is one of the most important reasons for the occurrence of continuous cropping obstacle. Therefore， the study of chemosensory substances in pea plants is of great importance to further understand the occurrence of continuous cropping obstacle in pea. In this study， root， stem and leaf extracts of different genotypes of field-grown peas at the seedling stage（Dingwan 10 and Yunwan 8） were aualyzed using GC-MS to clarify the differences of chemical susceptibility substances in different organs of peas. The results showed that the compound composition in different organs of Yunwan 8 were higher than those of Dingwan 10. Two pea cultivars had more compounds in above-ground organs than in the roots. There were differences in the types of chemosensory substances with a high relative content in different organs. Among them， antioxidant 2246 was present in different organ extracts of both genotypes except for leaf extracts of Dingwan 10. In addition， palmitic acid and erucic acid amide were present in different organ extracts of Yunwan 8. Cinnamic acid was present only in the stem extract of  Dingwan 10. In conclusion， all different organ extracts of pea exist chemosensory substances， but their chemical compositions are varied with organ type and pea genotype.

Key words： Pea; Extract from different organ; Allelopathic substance; GC-MS

收稿日期：2023 - 09 - 15

作者简介：郑立龙（1972 — ），男，山西万荣人，副研究员，主要从事农业科技信息及作物抗旱及生理生化研究工作。Email： 369973058@qq.com。

豌豆（Pisum sativum L.）作为我国重要的农作物之一［1 ］，其产量的稳定性及优良品质是我国农业关注的重要问题之一。近年来由于经济利益的驱动使豌豆种植呈产业化、规模化生产。另外，随着我国经济快速发展，人口基数增加，耕地面积逐年减少，耕地复种指数显著上涨，且不同作物对光照、温度等环境因子的需求不同导致连作现象普遍发生，严重影响豌豆的生长发育和产量形成［2 - 3 ］。因此加强对作物连作障碍机理的研究，有利于对后期缓解甚至解决豌豆连作障碍提供新思路和理论依据。连作障碍成因复杂，其中植物体分泌的化感物质引发的自毒效应是造成连作障碍的主要原因之一［4 ］。化感物质几乎存在于植物的根、茎、叶、花、果实、种子等所有器官中［5 - 6 ］，主要通过雨雾淋溶、自然挥发、植物残体与凋落物分解以及根系分泌等途径向周围环境释放化学物质，从而影响自身及其周围其他植物的生长［7 - 10 ］。植物化感物质的种类和成分与植物自身基因型、生长期以及外界环境条件等密切相关［11 - 13 ］。不同类型植物的化感物质的种类与数量有明显差异，且同一植物在不同生育期化感物质的种类与浓度也有较大的差别［14  ］。因此，探究作物不同器官存在的化感物质对于揭示作物连作障碍的发生机理具有重要意义。

化感物质主要是植物的次级代谢物，根据结构和成分的不同，一般将常见的自毒物质分为14类［15 - 16 ］，涉及酚类、萜类、糖和糖苷类、生物碱和非蛋白氨基酸等［8 ］。如李琴琴［17 ］采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）在小豆根、茎、叶和根际土壤浸提液中检测到邻苯二甲酸氢钾、肉桂酸和对羟基苯甲酸等化感物质。陈君良［7 ］通过GC-MS在百合根系分泌物中分离出了棕榈酸、抗氧剂2246等化感物质，说明通过GC-MS可鉴定植物体中的化感物质［7 ］。豌豆种植中面临连作危害，喻景权等［18 ］发现豌豆根系分泌物中存在化感物质，这些物质的积累可能是引发连作障碍的原因之一。但化感物质是否仅存于根系分泌物中，还是在豌豆植株不同器官中均存在，且化感物质种类是否有组织特异性等问题目前均未深入研究。因此，笔者采用GC-MS对苗期不同基因型豌豆的根、茎、叶浸提液成分及其相对含量进行了鉴定及分析，以期为进一步研究豌豆化感物质在连作障碍中的作用提供理论基础和科学依据。

1   材料与方法

1.1   供试材料

指示豌豆品种为定豌10号、云豌8号，均由定西市农业科学院提供。

1.2   试验方法

1.2.1    豌豆不同器官的获取    不同基因型豌豆于2022年4月播种于甘肃省定西市安定區榆河村豌豆试验基地，待豌豆生长至苗期时，采集不同基因型豌豆植株置于4 ℃冰盒中，并带回实验室进行后续试验。

1.2.2    豌豆根、茎、叶水浸提液的制备    参照宋慧［19 ］的方法（稍作调整）将采集的豌豆植株根、茎、叶分离，并自然风干后粉碎过60目筛。取10 g的样品，加入100 mL无菌水，振荡、浸提、过滤得滤液，取50 mL备用。

1.2.3    各器官浸提液中化感物质的分离、纯化    参照宋慧［19 ］的方法进行豌豆各器官浸提液中化感物质的分离与纯化。用分析纯二氯甲烷萃取50 mL浸提液溶液2次，每次添加二氯甲烷125 mL，旋转蒸发仪 45 ℃ 减压浓缩至干，加入2 mL色谱纯二氯甲烷溶解，过0.45 μm滤膜，0.5 mL用于GC-MS上样分析［19 ］。

1.2.4    各器官浸提液的GC-MS分析    参照宋慧［19 ］的方法进行各器官浸提液的GC-MS分析。采用电子轰击源，轰击电压70 eV，离子源温度230 ℃，进样口温度260 ℃，柱温50 ℃（保持5 min），以 5 ℃/min程序升温至 250 ℃（保持10 min）。扫描范围M/Z 35～550 amu，毛细管柱规格30 m×0.32 μm×0.25 mm，载气为He，流量 1 mL/min，不分流进样，进样量为1 μL［19 ］。

1.3   数据处理

与标准图谱库 NIST08 对比并进行人工分析，确定各组分物质结构及名称。相对含量指各组分在 GC-MS 分析中出峰面积占总峰面积的比例（/%）［20 - 21 ］。

2   结果与分析

2.1   定豌10号不同器官浸提液的化感物质鉴定

2.1.1    根系浸提液化感物质    从表1可以看出，定豌10号根系浸提液成分共有20种，烃类、醇类化合物各6种，酮类和酰胺类化合物各2种，酯类、醛类、酚类、其他化合物各1种，其中相对含量最高的是抗氧剂2246（20.77%），其次是芥酸酰胺（16.97%）、4-（3- 羟基丁基）-3，5，5-三甲基环己烷 -2- 烯 -1- 酮（11.31%）、1-十九碳烯（7.41%）。

2.1.2    茎秆浸提液化感物质    定豌10号茎秆浸提液二氯甲烷提取液的GC-MS鉴定成分结果（表2）表明，定豌10号茎秆浸提液中存在29种化合物，其中酯类化合物10种、酸类化合物7种、烃类化合物5种、醛类化合物4种、酚类化合物2种、醇类化合物1种，其中相对含量排名前四的化合物分别是棕榈酸（13.91%）、肉桂酸（11.96%）、肉豆蔻酸（8.17%）、抗氧剂2246（8.04%）。

2.1.3    叶片浸提液化感物质    定豌10号叶片浸提液鉴定成分结果（表3）表明，定豌10号叶片浸提液共检测出33种化合物，其中烃类化合物18种，酯类化合物12种，醛类化合物、醇类化合物、苯类化合物各1种。其中烃类和酯类在所有化合物中占有的比重较大，相对含量较高的前四种物质分别是正十九酸甲酯（42.47%）、棕榈酸甲酯（14.73%）、硬脂酸甲酯（8.57%）、4-N-丙基苯甲醛（5.41%）。 2.2   云豌8号不同器官浸提液的化感物质鉴定

2.2.1    根系浸提液化感物质    从表4可以看出，云豌8号根系浸提液中共检测7类36种化合物，包括烃类化合物16种、酯类化合物6种、醇类化合物5種、酮类化合物4种、酚类化合物和酸类化合物各2种、酰胺类化合物1种，其中烃类和酯类化合物占大多数，根系水浸提液相对含量较高的化合物分别是抗氧剂2246、芥酸酰胺、棕榈酸、正-二十二醇，相对含量分别为23.40%、20.28%、13.85%、7.80%。

2.2.2    茎秆浸提液化感物质    由表5可知，云豌8号茎秆浸提液中的化合物主要有9类40种，包括烃类化合物12种、醇类化合物8种、酮类化合物5种、酸类化合物5种、酯类化合物和酚类化合物各3种、醛类化合物2种，酰胺类化合物和其他化合物各1种，其中烃类、醇类、酮类和酸类物质占大多数，相对含量较高的物质分别是棕榈酸（15.67%）、芥酸酰胺（14.37%）、4-乙基苯酚（8.72%），抗氧剂2246（7.39%）。

2.2.3    叶片浸提液化感物质    由云豌8号叶片浸提液分析结果（表6）可以看出，云豌8号叶片浸提液中存在8类37种化合物，其中包括烃类化合物10种，醇类化合物6种，酯类化合物、酮类化合物和酸类化合物各5种，醛类化合物4种，酚类类化合物和酰胺类化合物各1种。相对含量最高的是棕榈酸，达35.57%；其次是蓖麻油酸，为9.76%；芥酸酰胺（8.73%）、抗氧剂2246（5.22%）含量较高。

2.3   定豌10号和云豌8号不同器官浸提液的化感物质鉴定结果分析

对豌豆植株不同器官浸提液的化感物质鉴定结果可知，在定豌10号、云豌8号的根系浸提液中分别检测到20种、36种化合物，茎秆浸提液中分别检测到29、40种化合物，叶片浸提液中分别有33、37种化合物。云豌8号不同器官浸提液中检测到的化合物种类多于定豌10号。2种豌豆的地上部器官中化合物种类多于根系。不同器官中相对含量较高的化感物质种类存在差异。其中，抗氧化剂2246除定豌10号的叶片浸提液外，在2种豌豆不同器官浸提液中均存在。此外，棕榈酸和芥酸酰胺在云豌8号的不同器官浸提液中均存在。肉桂酸仅在定豌10号茎浸提液中存在。

3   讨论与结论

豌豆作为典型的忌连作作物，连作时不仅会导致病虫害加剧，还会导致产量降低、品质下 降［20 - 21 ］。喻景权等［18 ］研究发现，豌豆根系分泌物中存在的化感物质可引起连作障碍。另有研究表明，不同品种、不同器官之间化感物质的含量和种类存在较大的区别［22 - 23 ］。然而目前有关豌豆不同器官中是否存在化感物质，及其化感物质的种类尚不清楚。本研究通过采用GC-MS技术分析了2种不同豌豆的不同器官浸提液中的化感物质种类及相对含量。结果表明，在定豌10号和云豌8号的根系浸提液中分别检测到20种、36种化合物，茎秆浸提液中分别检测到29、40种化合物，叶片浸提液中分别有33、37种化合物。云豌8号不同器官浸提液中检测到的化合物种类多于定豌10号。这可能是由于豌豆是一种遗传多样性较高的植物，长期的选育导致每个豌豆都具有自己独特的遗传背景。其中可能包括基因变异和多态性，并影响豌豆中的代谢途径、酶活性以及其他相关的生物化学反应，从而出现不同豌豆中化合物的差异。此外，我们发现，2种豌豆地上部器官中化合物种类均多于根系，这可能是由于叶片进行光合作用，利用光能将二氧化碳和水转化成有机物质。此外，地上部且易受到外界环境因素的影响，如干旱，虫害等，需要合成更多防御性化合物来应对外界侵害，从而导致地上部器官化合物种类多于根系。

目前普遍认为低分子有机酸、酚类及萜类为最常见的化感物质［24 - 26 ］。喻景权等［18 ］从豌豆的根系分泌物中鉴定出以肉桂酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸为代表的多种酚酸类化感物质。宋慧［19 ］从小豆不同器官及根际土壤浸提液中分离出了邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸等有机酸类物质，并发现三者均会对小豆的生长产生抑制作用。本研究对豌豆不同品种的不同器官浸提液成分进行鉴定，在定豌10号的茎秆同样也发现肉桂酸、肉豆蔻酸等有机酸的存在，且相对含量都较高，但其化感活性的大小及对不同豌豆的影响程度还有待进一步验证。陈君良［7 ］利用GC-MS技术从百合根系分泌物中分离出抗氧剂2246、棕榈酸、邻苯二甲酸异辛酯等物质，并证实了抗氧剂2246和棕榈酸会对百合的生长产生化感抑制效应，本研究中从定豌10号的根系和茎秆中，云豌8号根系、茎秆、叶片均检测到抗氧剂2246，从定豌10号的茎秆中及云豌8号根系和茎秆中均检测到棕榈酸。但这两种物质是否会对豌豆产生化感作用目前尚不清楚。与以往研究结果不同的是，本研究中从云豌8号的根、茎、叶中均检测前人未发现的化感物质芥酸酰胺，且相对含量在不同的组分中均较高。基于上述研究表明，豌豆不同器官中，肉桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、抗氧剂2246及芥酸酰胺中具有化感作用潜力的成分，后续可进一步进行生物学验证来探究其化感作用的强弱。

参考文献：

［1］ 王正德.  豌豆分离蛋白对面团特性影响及其产品开发的研究［D］.  泰安：山东农业大学，2018.

［2］ 张   允.  不同豌豆栽培基质中化感物质的分离鉴定和生物学效应研究［D］.  兰州：甘肃农业大学，2018.

［3］ 韩海蓉，李   屹，陈来生，等.  设施辣椒连作对土壤理化性状、酶活性及微生物区系的影响［J］.  中国土壤与肥料，2021（3）：237-242.

［4］ 张晓玲，潘振刚，周晓锋，等.  自毒作用与连作障碍［J］.  土壤通报，2007（4）：781-784.

［5］ 辜   睿.  不同养分水平下外来入侵植物南美蟛蜞菊及其本地亲缘植物蟛蜞菊的化感作用研究［D］.  成都：成都理工大學，2021.

［6］ 刘淑霞，潘冬梅，魏国江，等.  大豆化感物质的产生途径、提取、分离及纯化［J］.  养殖技术顾问，2011（3）：244-245.

［7］ 陈君良.  兰州百合根系分泌物自毒作用的研究及化感物质的GC-MS分析［D］.  兰州：甘肃农业大学，2016.

［8］ 师小平，陈银萍，闫志强，等.  植物化感作用研究进展［J］.  生物技术通报，2020，36（6）：215-222.

［9］ 卢   红，李   明，李龙明.  广藿香植株水提液的化感自毒作用［J］.  北方园艺，2021（16）：108-115.

［10］ 刘   勇，刘   燕，王星星，等.  头花蓼整株及根际土壤水浸提液的化感自毒作用［J］.  江苏农业科学，2019，47（17）：266-270.

［11］ 杨珊珊，王   茜，胡庭兴，等.  3种农作物（玉米、黄瓜、豇豆）对银木凋落叶化感作用的生理响应［J］.  应用与环境生物学报，2018，24（2）：292-298.

［12］ 朱博超.  黄土高原针叶纯林腐殖层土壤对林下拟混交植物的化感效应［D］.  杨凌：西北农林科技大学，2015.

［13］ 拱健婷，张子龙.  植物化感作用影响因素研究进展［J］.  生物学杂志，2015，32（3）：73-77.

［14］ 魏传斌，张   萍.  北美车前抽提液对常见十字花科蔬菜种子萌发特性的影响［J］.  安徽农业科学，2014，42（12）：3559-3560；3564.

［15］ 陈静雯，张   丽.  植物化感作用的机理及应用前景［J］.  生物学通报，2008，43（11）：11-15.

［16］ CHON S， JANG H， KIM D， et al.  Allelopathic potential in lettuce（Lactuca sativa L. ） plants［J］.  Scientia Horticulturae， 2005， 106（3）： 309-317.

［17］ 李琴琴.  小豆不同器官与根际土壤浸提液的自毒作用研究［D］.  杨凌：西北农林科技大学，2013.

［18］ 喻景权，松井佳久.  豌豆根系分泌物自毒作用的研究［J］.  园艺学报，1999（3）：37-41.

［19］ 宋   慧.  小豆连作障碍中自毒机理研究［D］.  杨凌：西北农林科技大学，2013.

［20］ 马绍英，陈桂平，王   娜，等.  豌豆土壤中潜在自毒物质的鉴定及自毒效应研究［J］.  草业学报，2023，32（6）：134-145.

［21］ 韩燕红，吕春霞，沙明贵.  豌豆/甘薯轻简高效栽培技术［J］.  江西农业，2019（8）：1.

［22］ 税军峰.  柳枝稷化感作用研究［D］.  咸阳：中国科学院研究生院（教育部水土保持与生态环境研究中心），2012.

［23］ 朱美秋.  毛白杨化感作用及其酚酸物质对其幼苗生长与生理影响研究［D］.  保定：河北农业大学，2010. ［24］ 刘   伟，魏莹莹，吕海花，等.  须根腐解对丹参根际土壤化感物质的影响［J］.  中药材，2016，39（10）：2203-2206.

［25］ 韩丽梅，王树起，鞠会艳，等.  大豆根分泌物的鉴定及其化感作用的初步研究［J］.  大豆科学，2000（2）：119-125.

［26］ 阎   飞，杨振明，韩丽梅.  植物化感作用及其作用物的研究方法［J］.  生态学报，2000，20（4）：692-696.